球孢白僵菌(Beaueria bassiana)是一种分布范围广、应用潜力大的病原真菌,是理想的生物防治材料。线粒体作为真核细胞的能量工厂,它含有自身的基因组DNA和双层膜结构。线粒体在细胞中通过融合分裂、线粒体自噬等方式自我更新,维持在功能活跃的稳态中。自噬是真核生物对自身物质周转的重要过程,它可以消化损伤或不必需的蛋白、细胞器等,为细胞提供可重复利用的资源和降低负担。本文通过构建和分析单基因敲除/回补菌株,研究解析球孢白僵菌线粒体相关基因BbFis1、BbDnm1、BbMdv1和自噬相关基因BbAtg6、BbAtg16对其生物学功能及生防潜力的影响。线粒体内膜结构基因BbMtf的功能解析线粒体的内膜向内弯曲形成嵴,这种弯曲结构大大增强了线粒体内空间的合理分区和利用。Mitofilin是维持线粒体内膜(IM)复杂结构的重要组织因子。在球孢白僵菌中,BbMtf也定位于线粒体上。在该基因缺失菌株中,线粒体内嵴散乱、嵴连接缺失,而野生株的线粒体中存在清晰的嵴连接,嵴排列比较整齐。BbMtf的缺失也影响了菌体能量的合成。敲除株ATP的产量相对于野生株下降了33%。BbMtf的缺失显著地影响了菌株的无性发育。敲除株分生孢子和芽孢的产量相对于野生株分别下降了40%和70%。在饥饿胁迫板上,敲除株分生孢子的萌发受到了显著的抑制。在毒力方面,体壁侵染和血腔注射两种生测实验中敲除株的半致死时间较野生株均显著的推迟。综上,BbMtf是维持球孢白僵菌线粒体内膜正常形态所必需的。它参与球孢白僵菌ATP的生物合成,并进而影响菌体的无性繁殖和感染宿主的过程。线粒体分裂相关基因BbFis1、BbMdv1和BbDnm1的功能解析已有的研究显示,Fis1、Mdv1和Dnm1三个基因调控真菌线粒体的分裂。在球孢白僵菌中,(35)BbFis1、(35)BbMdv1和(35)BbDnm1缺失株的线粒体均呈现体积增大的现象。在三个基因缺失株中,ATP合成受到了抑制,相对于野生株下降幅度为12-16%。三个基因的缺失也影响了球孢白僵菌的生长发育和无性繁殖。在营养丰富的SDAY板和碳、氮源不同的CZA板上,敲除株的生长速率受到抑制。在SDAY平板上,敲除株分生孢子的产生缓于野生株,然而8天之后敲除株与野生株的产孢量并无明显的差别。在SDB培养液中,敲除株芽孢的产量也低于野生株。三株基因缺失菌株均表现出孢子致病力显著下降。此外,在三个基因缺失菌株中,线粒体自噬均被显著地阻断。亚细胞定位显示BbFis1定位在线粒体上的。综上,在球孢白僵菌中,BbFis1、BbMdv1和BbDnm1均是维持线粒体分裂所必需的。它们通过影响ATP产生和线粒体自噬,并进而决定菌体无性繁殖能力和致病力。自噬基因BbAtg6和BbAtg16的功能解析自噬是真核生物进化过程中非常保守的一种分解代谢途径。ATG6和ATG16都是作为核心基因参与自噬的,它们分别作用于自噬前期和中期。在球孢白僵菌中,BbAtg6和BbAtg16也发挥了重要的自噬作用。在透射电镜下观察,两个基因的敲除株中自噬体的形成出现了障碍。细胞中3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)由GFP-2×FYVE指示。BbATG6的缺失影响了菌体中PtdIns3P的数量和分布。BbATG6和BbATG16参与了球孢白僵菌无性发育的过程。敲除株分生孢子和芽孢的产量都明显低于野生株,并且发现BbATG16在无性发育上发挥着比BbATG6更明显的作用。此外,这两个基因也参与到球孢白僵菌与寄主的互相作用,它们的缺失显著地削弱了菌株的致病力。综上,BbATG6和BbATG16作为细胞自噬的关键基因,参与了球孢白僵菌的无性繁殖和与宿主之间的互作。