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背景与目的疼痛是晚期癌症患者普遍存在的现象,约75%-95%的晚期癌症患者具有剧烈的疼痛。癌症诱导的骨性疼痛(骨癌痛)是癌性疼痛的典型代表,是一种独特的疼痛状态,其临床上主要表现为持续进行性的背景痛、突破痛和痛觉异常。虽然“三阶梯止痛疗法”早在1982年就由世界卫生组织(World Health Organization,WHO)提出,但由于阿片类药物的毒副反应等限制了其临床广泛应用,目前仍有45%的癌痛患者未能得到有效控制,目前防治癌痛尚缺乏特异性手段。考虑目前临床治疗骨癌痛所面临的挑战,研究骨癌痛的形成机制对制定安全有效的癌痛防治措施具有重要意义。研究发现,Mas相关基因受体C(Mas oncogene-related gene C receptor,MrgC)是一种新型 G 蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCRs),特异性分布在与痛觉产生和传导密切相关的背根神经节(Dorsal root ganglia,DRG)及脊髓背角(Spinal cord dorsalhorn,SCDH)的神经元上,对疼痛的感受和调节具有重要作用。MrgC参与调控神经损伤后痛觉信号的传导及突触可塑性,然而MrgC在骨癌痛中的确切效能和作用机制国内外鲜见报道。但MrgC分布的独特性提示其可作为防治疼痛的潜在新靶点,以期基于此靶点研发出只作用于外周而不影响中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的专一、高效、副作用小的镇痛药,为临床防治骨癌痛带来新的希望。本研究拟在小鼠股骨骨癌痛模型基础上,深入探讨脊髓神经元MrgC在骨癌痛形成中的作用及相关机制,为探索相应的临床防治措施提供理论依据。方法(1)使用雄性C3H/HeJ小鼠和NCTC 2472纤维肉瘤细胞株,建立小鼠股骨骨癌痛模型。通过自发抬足次数/2 min(Number of spontaneous flinches,NSF)、机械性刺激缩足反应阈值(Paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)测试评估疼痛行为学改变,组织切片H-E染色观察肿瘤生长情况及骨质破坏程度确定骨癌痛造模是否成功。(2)采用Western Blotting、免疫荧光组织化学测定脊髓水平MrgC、Gai、NR2B及nNOS在骨癌痛形成中的表达及活性变化情况。(3)分别通过单次/重复多次鞘内给予不同剂量的MrgC激动剂BAM8-22(0.8 nmol/5 μl、2.4nmol/5μl、8.0nmol/5μl),检测小鼠NSF、PWMT评估疼痛行为学改变;并取脊髓L3-5节段,分别采用Western Blotting、免疫荧光组织化学技术检测脊髓水平MrgC、Gai、NR2B及nNOS的表达及活性变化。(4)通过鞘内注射MrgC激动/拮抗剂、NR2B拮抗剂,观察小鼠疼痛行为学改变,并取脊髓L3-5节段,分别应用Western Blotting、疫荧光组织化学及钙离子成像技术检测MrgC、Gai、NR2B及nNOS的表达水平、活性变化及神经元内Ca2+浓度,探讨脊髓水平MrgC-Gai-NR2B-nNOS信号通路在骨癌痛中的调节作用。结果(1)疼痛行为学及组织切片H-E染色检测结果提示:小鼠右后肢股骨骨髓腔在接种NCTC 2472纤维肉瘤细胞株后第7-14 d NSF增加,PWMT降低(P<0.05),且肿瘤组小鼠右后肢股骨HE染色见骨髓骨小梁间被大量肿瘤细胞浸润,并出现骨皮质破坏,提示骨癌痛小鼠动物模型的成功建立。(2)Western Blotting及免疫荧光组织化学结果显示:与假手术对照组相比,骨癌痛小鼠脊髓水平MrgC、Gai、NR2B及nNOS在肿瘤细胞接种后7-14 d时表达显著增加,活性增强(P<0.05),并在时相上与疼痛行为学结果基本一致。(3)骨癌痛小鼠接种后第14 d分别经单次或重复多次鞘内注射不同剂量的MrgC高选择性激动剂BAM8-22后,中、高剂量组(2.4nmol/5 μl、8.0nmol/5μl)小鼠的NSF显著减少(P<0.05),PWMT显著增高(P<0.05)。单次鞘内给药后1h疼痛行为学显著改善,2 h达到高峰,但仍未能达到假手术组水平,12 h后逐渐减弱,24 h后消失。在此基础上,进一步模拟临床上癌痛患者急需镇痛药物治疗时期的给药方式,即从肿瘤细胞接种后第14 d开始,连续鞘内给药8 d,1次/d。肿瘤细胞接种后第14-21 d鞘内给药后疼痛行为学趋于稳定,且在给药后2h,中、高剂量组(2.4nmol/5μl、8.0nmol/5μl)小鼠的疼痛行为学显著改善(P<0.05),其中高剂量组(8.0nmol/5μl)镇痛作用更为显著(P<0.05);而低剂量组(0.8nmol/5μ1)镇痛作用不明显(P>0.05)。而鞘内注射MrgC替代性拮抗剂anti-MrgC抗体则产生了致痛效应。从本实验中可见,BAM8-22可以剂量依赖性的改善骨癌痛。(4)Western Blotting、免疫荧光组织化学及钙离子成像技术结果显示:与骨癌痛对照组比较,鞘内注射高剂量BAM8-22(8.0nmol/5 μl)能显著上调脊髓水平MrgC、Gai的表达,下调脊髓水平p-NR2B、t-nNOS及p-nNOS表达(P<0.05),并抑制了脊髓神经元内Ca2+浓度。鞘内注射MrgC替代性拮抗剂anti-MrgC抗体显著下调脊髓水平MrgC、Gαi的表达,同时上调脊髓水平p-NR2B、t-nNOS及p-nNOS表达(P<0.05),且鞘内给药后lh起效,2h达到高峰,12h后逐渐减弱,24 h后作用消失,此与行为学结果基本保持一致。(5)肿瘤细胞接种后第14 d,干预MrgC-Gαi-NR2B-nNOS信号通路,如采用MrgC高选择性激动剂BAM8-22、MrgC替代性拮抗剂anti-MrgC抗体、NR2B选择性拮抗剂艾芬地尔等,给药后2 h能显著改变骨癌痛小鼠的疼痛行为学,同时调控脊髓水平MrgC、Gai、NR2B及nNOS的表达及活性(P<0.05)。结论(1)脊髓水平MrgC在小鼠骨癌痛的形成中具有重要作用。(2)激活MrgC后可有效缓解骨癌痛小鼠的疼痛行为学,可能是通过激活Gai、抑制NR2B/nNOS的表达和活性而发挥作用。(3)干预脊髓水平MrgC-Gai-NR2B-nNOS信号通路,调控其下游信号物质的表达和活性,可以抑制脊髓神经元Ca2+内流,从而有效改善骨癌痛小鼠的疼痛行为学。