论文部分内容阅读
第一部分乳腺癌中NDRG1基因异常甲基化分析目的探讨乳腺癌中人类N-myc下游调节基因1(N-myc downstream regulated gene,NDRG1)基因启动子区甲基化与该基因的表达及临床病理特征的相关性。方法半定量RT-PCR、Western blot检测人乳腺癌细胞株T47D、SK-BR-3及MCF7的mRNA和蛋白表达;以NDRG1基因启动子区-379～+86区域设计引物进行重亚硫酸盐克隆测序(Bisulfite Sequencing PCR,BSP),并结合甲基化特异性PCR(MSP)检测三种乳腺癌细胞株的甲基化状态;进一步采用去甲基化药物5-氮杂-2’脱氧胞苷(AZA)处理细胞株T47D,观察该细胞株NDRG1基因的mRNA和蛋白表达状况;半定量RT-PCR和MSP方法分别检测乳腺癌组织中NDRG1基因的mRNA表达及甲基化状态。结果RT-PCR及Western blot法检测结果表明,NDRG1在乳腺癌细胞株SK-BR-3及MCF7中均有表达,而NDRG1在T47D细胞株中表达缺失。BSP克隆测序法检测结果显示NDRG1基因在乳腺癌细胞株T47D中的平均甲基化百分数为66%,在SK-BR-3及MCF7细胞株中NDRG1基因的平均甲基化百分数分别为9%及15%;NDRG1基因的甲基化在其表达与表达缺失的细胞株中,不同的甲基化位点为CpGs 13-17,20-23和35-40(-379～+89区域内的第一个CpG位点设为1)。以不同的甲基化位点CpGs 15-17,35-38所在序列设计MSP的上下游引物,检测三个乳腺癌细胞株,结果显示NDRG1基因在T47D细胞中呈甲基化状态,在SK-BR-3及MCF7细胞株中呈非甲基化状态。由于NDRG1基因在细胞株T47D中表达缺失,且BSP克隆测序显示NDRG1基因呈高甲基化状态,进一步采用去甲基化药物AZA处理该细胞株,观察NDRG1基因的表达情况,结果显示AZA可以逆转T47D细胞株中NDRG1基因mRNA及蛋白的表达。半定量RT-PCR检测结果显示,87例乳腺癌组织中,乳腺癌组织NDRG1基因表达缺失率为51.7%(45/87);而在相应的癌旁组织中,NDRG1基因表达缺失率为11.5%(10/87),乳腺癌组织NDRG1基因的表达明显低于癌旁组织(P=0.000)。MSP方法检测结果显示,87例乳腺癌组织中NDRG1基因的甲基化频率为36.8%(32/87),癌旁组织中NDRGh1基因的甲基化频率为14.9%(13/87),乳腺癌组织NDRG1基因的甲基化频率明显高于乳腺癌旁组织(P = 0.000)。32例发生甲基化的乳腺癌组织中,NDRG1基因表达缺失率为77.1%(27/32),而55例非甲基化的乳腺癌组织中,NDRG1基因表达缺失率为32.7%(18/55),甲基化组NDRG1基因表达缺失率明显高于非甲基化组(P=0.000)。13例甲基化的乳腺癌旁组织中,NDRG1基因表达缺失率为69.2%(9/13),74例非甲基化的乳腺癌旁组织中,NDRG1基因表达缺失率为1.3%(1/74),甲基化组NDRG1基因表达缺失率明显高于非甲基化组(P = 0.000)。进一步扩大标本数量,对302例乳腺癌石蜡包埋组织标本进行甲基化状态检测,综合87例冰冻乳腺癌组织标本的检测结果,389例乳腺癌组织标本中的甲基化频率为31.1%(121/389)。在389例乳腺癌组织中,NDRG1基因的甲基化与临床病理特征相关分析结果显示,该基因的甲基化与乳腺癌的组织学分级处于Ⅱ级[ORs:1.89(95%CIs,1.20-3.20)、Ⅲ级 ORs:2.96(95%CIs,1.19-7.39)]、体外转移[ORs:1.94 95%CIs,(1.10-3.40)]、TNM分期 Ⅲ/Ⅳ[ORs:2.82(95%CIs,1.41-5.62)]及淋巴浸润[OR:2.22(95%CI,1.19-4.11)]密切相关,与妇女绝经年龄、肿瘤大小、P53突变情况、HER2表达及K67增殖率无明显相关。结论乳腺癌组织中NDRG1基因mRNA表达较乳腺癌旁组织低,该基因的表达受其启动子区异常甲基化的调控,NDRG1基因启动子区甲基化状态与乳腺癌的组织学分级、体外转移、TNM分期及淋巴浸润密切相关。第二部分BRCAI基因CpG岛甲基化特异位点对转录活性的影响目的探讨乳腺癌易感基因 1(breast cancer susceptibility gene1,BRCA1)基因启动子区甲基化所致转录抑制作用具有CpG位点特异性。方法在BRCA1基因启动子区转录起始点附近-247～+175区域(转录起始点为+1)设计5个含不同CpG位点的不同长度片段F200、F204、F281、F422及F178,构建载体,克隆提取质粒后采用CpG甲基化酶M.SssI进行修饰,双荧光素酶报告系统(Dual-Luciferase Reporter Assay System)试剂盒检测M.SssI修饰前后与报告基因载体连接后的5个启动子片段荧光素酶的活性。结果5个启动子片段质粒转染MCF7细胞后,双荧光素酶报告系统检测结果显示,F422和F281荧光素酶活性比F204、F200、F178及空白对照Basic的活性高(P<0.05);F204荧光素酶活性明显比F178及Basic活性高(P<0.05);F200和F178荧光素酶活性之间差异无显著性(P>0.05),二者分别与Basic活性比较,差异无显著性(P>0.05)。5个片段质粒在转染MCF7细胞株前经甲基化酶M.SssI处理,分别与非甲基化的片段相比,甲基化酶处理后,F281片段的荧光素酶活性降低了 60%,F422片段荧光素酶活性降低了58%,F204片段荧光素酶活性降低了 20%。而其它片段的荧光素酶活性无明显降低。结论BRCA1基因启动子区影响转录活性的特异CpG位点位于-37～-19区段。