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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一种农产品及饲料中检出率较高的类雌激素样霉菌毒素,严重危害畜牧业的健康发展。研究表明,ZEA具有生殖毒性,可影响动物的繁殖性能。目前,国内外对ZEA雌性生殖毒性的研究主要集中在猪卵母细胞与颗粒细胞中,对猪子宫内膜基质细胞(Endometrial stromal cells,ESCs)毒性损伤的研究鲜有报道。因此,本试验以ESCs为研究对象,基于内质网/线粒体途径激活JNK通路研究ZEA诱导猪ESCs凋亡的分子机制。首先采用CCK-8法检测细胞存活率,并以此选择ZEA与抑制剂的最适浓度;使用透射电镜观察超微结构;激光共聚焦显微镜检测细胞生长状态及Cyt C的表达与分布;流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、ROS以及Ca2+水平变化;采用q RT-PCR技术检测ERS、JNK通路以及凋亡相关基因相对表达量;WB检测ERS、JNK通路蛋白以及凋亡相关蛋白表达水平,综合评价ZEA对猪ESCs的毒性损伤及其分子作用机制。试验结果:1.ZEA对猪ESCs毒性损伤作用。结果显示,ZEA浓度为15μM时,极显著降低细胞活率(P<0.01),达到半数抑制浓度;内质网应激抑制剂(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)浓度为1.5μM,线粒体分裂抑制剂(Mitochondrial division inhibitor,1Mdivi)浓度为1.0μM时,对细胞无损伤作用,同时能够显著缓解ZEA对细胞存活率的抑制作用(P<0.01)。激光共聚焦显微镜观察显示随着ZEA浓度增加,Calcein-AM染色后绿色荧光显著减弱,红色荧光逐渐增强,表明死细胞较活细胞比例增加;透射电镜观察可见细胞出现皱缩,内质网与线粒体断裂,染色质聚集,细胞膜受损等情况,表明ZEA可诱导猪ESCs细胞生长状态与超微结构的损伤,且呈剂量依赖性关系。2.ZEA通过内质网途径激活JNK通路诱导细胞凋亡。结果显示,与CON组相比,ZEA组ROS、Ca2+水平以及细胞凋亡率均极显著升高(P<0.01),4-PBA组无显著变化(P>0.05);与ZEA组相比,P+Z组ROS、Ca2+水平及细胞凋亡率极显著下降(P<0.01)。通过q RT-PCR与WB检测结果显示,ZEA组CHOP、GRP 78、HSP 70、PERK和ASK 1基因与蛋白表达水平与CON组相比均极显著上升(P<0.01),Caspase3、Caspase 9、Bax/Bcl-2基因与蛋白表达水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01),ZEA组JNK m RNA及核蛋白p-JNK表达水平较CON组极显著升高(P<0.01);4-PBA组与CON组相比,各基因均无显著变化;与ZEA组相比,P+Z组CHOP、GRP 78、HSP 70、PERK、ASK 1、Caspase 3和Caspase 9基因与蛋白表达水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),JNK m RNA相对表达量较ZEA组极显著下降(P<0.01),核蛋白p-JNK表达水平极显著降低(P<0.01)。3.ZEA通过线粒体途径激活JNK通路诱导细胞凋亡。结果显示,与CON组相比,ZEA组ROS、Ca2+水平及细胞凋亡率极显著升高(P<0.01),MMP极显著下降(P<0.01),Mdivi组无显著变化(P>0.05);添加Mdivi后,M+Z组与ZEA组相比,ROS、Ca2+水平及细胞凋亡率极显著下降(P<0.01),MMP极显著上升(P<0.01)。免疫荧光结果显示,ZEA组Cyt C释放明显;WB检测显示,ZEA能够极显著升高细胞内Cyt C表达水平(P<0.01);M+Z组内Cyt C蛋白表达水平较ZEA组极显著降低(P<0.01)。通过q RT-PCR与WB检测结果显示,与对照组相比,ZEA组Mfn 1、Mfn 2基因与蛋白表达水平极显著降低(P<0.01),Fis 1与Drp 1、Bax/Bcl-2、Caspase3、Caspase 9基因与蛋白表达水平极显著升高(P<0.01),ZEA组JNK m RNA与核蛋白p-JNK表达水平较CON组极显著升高(P<0.01);与ZEA组相比,M+Z组Mfn 1、Mfn 2基因与蛋白表达水平显著升高(P<0.05),Fis 1、Drp 1、Bax/Bcl-2、Caspase 3、Caspase 9基因与蛋白表达水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),JNK m RNA较ZEA组极显著下降(P<0.01),核蛋白p-JNK表达水平极显著降低(P<0.01)。综上所述,猪ESCs暴露于ZEA中,可造成细胞产生过量的ROS、Ca2+,导致细胞MMP下降,细胞凋亡率升高,引起细胞ERS与线粒体分裂,激活JNK信号通路后诱导细胞凋亡。当抑制内质网与线粒体途径后,可有效缓解ZEA对猪ESCs的损伤作用,减少细胞凋亡。