【摘 要】
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目的:心肌梗死（myocardial infarction,MI）是以心肌缺血性坏死为主要表现的心血管疾病。心肌梗死后心排血量降低,心肌纤维化,心室重构,最终导致心力衰竭。这给患者家庭及社会造成了巨大的经济负担。随着心脏再生医学的发展,大量研究证实干细胞可以直接分化成心肌细胞,还能通过外泌体（exosomes,Exos）旁分泌作用实现心脏组织修复。前期研究发现干细胞源外泌体可以在心肌缺血时传递具有
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目的:心肌梗死（myocardial infarction,MI）是以心肌缺血性坏死为主要表现的心血管疾病。心肌梗死后心排血量降低,心肌纤维化,心室重构,最终导致心力衰竭。这给患者家庭及社会造成了巨大的经济负担。随着心脏再生医学的发展,大量研究证实干细胞可以直接分化成心肌细胞,还能通过外泌体（exosomes,Exos）旁分泌作用实现心脏组织修复。前期研究发现干细胞源外泌体可以在心肌缺血时传递具有心脏保护作用的micro RNA-451（mi R-451）,而mi R-451可以靶向结节性硬化症蛋白1（Tuberous Sclerosis-1,TSC1）调控自噬。本研究拟在小鼠心肌梗死模型的基础上,观察益气活血方（Yiqihuoxue Formula,YQHXF）预处理干细胞抗原-1阳性表达的心脏祖细胞（Sca-1+CPCs）源外泌体中mi R-451对心脏自噬的影响,从mi R-451靶向TSC1调控心肌细胞自噬的角度,探讨YQHXF治疗心肌梗死的细胞分子机制。方法:（1）本研究采用酶消化法培养实验所需的小鼠心脏原代细胞;利用免疫磁珠法分选Sca-1+CPCs,流式细胞术鉴定其表面标记物的表达。（2）采用PEG4000沉淀法提取P3-P6代Sca-1+CPCs培养液中外泌体;透射电镜负染观察外泌体形态学特征;纳米颗粒追踪分析测量外泌体的大小及分布;免疫印迹法检测外泌体表面标志物CD63、CD81、TSG101表达。（3）实时荧光定量聚合酶链式反应检测YQHXF预处理Sca-1+CPCs源外泌体中mi R-451的表达。（4）将C57BL/6小鼠随机分为5组:Sham组、MI组、PBS组、exo-blank组、exo-drug组,每组9只,通过左前降支结扎构建小鼠急性心肌梗死模型,并分别在梗死区域注射PBS和外泌体,分析比较各组术后7d/28d的心功能:左室射血分数、左室短轴缩短百分率、术后3d各组自噬相关蛋白表达:TSC1、Beclin-1、LC3B-II/I、p62,术后7天自噬相关基因表达:mi R-451、TSC1、Beclin-1、LC3B-II/I、p62。（5）运用网络药理学分析YQHXF治疗心肌梗死的作用和机制。结果:（1）体外分离培养的小鼠Sca-1+CPCs经分选,表面阳性标志物高达97.0%。（2）采用PEG4000沉淀法收集细胞上清中外泌体,通过透射电镜可观察到典型托盘状、双层膜结构吗,纳米颗粒追踪分析测得外泌体平均颗粒直径137.1±47.7 nm,免疫印迹法发现CD63、CD81、TSG101呈阳性表达。（3）实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,与exo-blank组相比,exo-drug组中外泌体的mi R-451水平显著升高。（4）超声结果显示,与sham组相比,术后7天各组心功能均显著降低,术后28天MI组和PBS组无差异,exo-blank组和exo-drug组心功能上升。免疫印迹结果显示,与sham组相比,MI组、PBS组TSC1、Beclin-1、LC3B-II/I蛋白表达水平升高,p62蛋白表达水平降低,与PBS组相比,exo-blank组和exo-drug组TSC1、Beclin-1、LC3B-II/I蛋白表达水平降低,p62蛋白表达水平升高。实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,与sham组相比,MI组和PBS组TSC1、Beclin-1、LC3B-II/I表达水平升高,mi R-451、p62表达水平降低,与PBS组相比,exo-blank组与exo-drug组TSC1、Beclin-1、LC3B-II/I表达水平降低,mi R-451、p62水平升高。（5）YQHXF中7味中药有150个活性成分,322个潜在靶点,其中64个与心肌梗死相关靶点有相互作用。富集结果显示核心靶点主要参与凋亡调控、脂多糖反应,缺氧反应、炎症反应和血管新生等生物过程,同时还参与了PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路、Fox O信号通路、HIF-1信号通路、细胞凋亡等多条信号通路。结论:（1）联合酶消化法和免疫磁珠筛选法可以从小鼠心脏组织中分离培养出大量的Sca-1+CPCs,且经过6次传代仍保持Sca-1高表达。（2）采用PEG4000沉淀法可以分离Sca-1+CPCs上清培养液中的微粒,经鉴定所分离的物质与外泌体特征一致。（3）YQHXF与Sca-1+CPCs共孵育可以提高外泌体中mi R-451的表达。（4）YQHXF预处理Sca-1+CPCs源外泌体部分通过mi R-451/TSC1抑制心肌自噬,改善小鼠心功能。（5）YQHXF存在多靶点、多成分、多通路、多治疗作用的特点,主要通过PI3K/Akt信号通路对心肌梗死发挥治疗作用。
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