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第一部分 MiR-21对颞叶癫痫大鼠的影响目的:研究匹罗卡品诱发颞叶癫痫(TLE)的最佳剂量,并探讨miR-21在氯化锂-匹罗卡品诱导的TLE大鼠模型海马中表达的变化规律,进一步通过miR-21激动剂(agomir)及miR-21抑制剂(antagomir)对大鼠双侧海马立体定位注射,阐明不同浓度miR-21 agomir和miR-21 antagomir在体内水平改变对大鼠痫性发作及行为学改变的影响,最后,利用生物信息学方法预测miR-21靶基因,为后续研究miR-21及其靶基因在下游信号通路的作用机制奠定基础。方法:(1)选取4-6周雄性SD大鼠,体重(170±30)g,根据不同浓度的匹罗卡品随机分为25 mg/kg组、35 mg/kg组和45 mg/kg组,经腹腔给予氯化锂和不同浓度匹罗卡品,构建TLE动物模型。观察不同浓度匹罗卡品注射后大鼠行为学、诱发成功率以及死亡率的改变。(2)选取4-6周雄性SD大鼠,体重(170±30)g,随机分为正常组(n=10)与癫痫组(亚组:1d组、14d组、28d组,各组n=10),经腹腔给予氯化锂和匹罗卡品(35 mg/kg)注射,构建TLE动物模型。Digital PCR检测miR-21在正常组及不同时间点TLE大鼠海马组织中的表达变化。(3)选取4-6周雄性SD大鼠,体重(170±30)g,随机分为TLE组(10只/组),miR-21 agomir 干预组(三个浓度亚组:miRNA-21 agomir 2 nmol 组、miR-21(4)agomir 4 nmol 组和 miR-21 agomir 6 nmol 组,各组 10 只)和 miR-21 antagomir 干预组(三个浓度亚组:miRNA-21 antagomir 2 nmol 组、miR-21 antagomir 4 nmol 组和 miR-21 antagomir 6 nmol 组,每组 10 只),予氯化锂-匹罗卡品注射构建TLE模型,观察不同浓度miR-21 agomir和miR-21 antagomir干预后大鼠行为学、诱发成功率以及死亡率的改变。(5)应用TargetScan和UCSC在线工具预测mi R-21的靶基因并做分析,结合相关文献确定需要预测的靶基因。使用293T细胞,利用RT-PCR方法对m RNA进行定量分析,内参为U6。获取靶位点片段后,构建重组质粒进行质粒测序。最后使用Lipofectamine 3000转染miR-21 mimics,使用双荧光素酶基因报告验证miR-21的靶点。结果:(1)随着匹罗卡品浓度增加,发作潜伏期显著缩短(组间比较均P<0.05);与25mg/kg组相比,35 mg/kg组和45 mg/kg组Racine分级和诱发成功率显著升高(P<0.05);与25mg/kg组和35 mg/kg组相比,45 mg/kg组死亡率增加显著(P<0.01)。(2)与正常组相比,TLE大鼠海马中各时间点(亚组:1d组,14d组,28d组)的miR-21表达均增加,其中1d组和28d组表达显著(P<0.01)。(3)随着miR-21 agomir浓度增加,4nmol组与6nmol组发作潜伏期显著缩短(P<0.05);各组间Racine分级和诱发成功率无显著差异(P>0.05);6nmol组较TLE组和2 nmol组死亡率增加显著(P<0.01)。(4)随着miR-21 antagomir浓度增加,4nmol组与6nmol组发作潜伏期显著延长(P<0.05);4nmol组与6nmol组Racine分级显著降低(P<0.05);4nmol组与6nmol组诱发成功率明显降低(P<0.01);各组间死亡率无统计学差异(P>0.05)。(5)转染3’ UTR miR-21-5p mimics的双荧光素酶相对活性较对照组显著降低(P<0.01)。结论:(1)激动大鼠海马中miR-21缩短TLE大鼠发作潜伏期,增加大鼠死亡率;抑制大鼠海马中miR-21延长TLE大鼠发作潜伏期,降低Racine分级和诱发成功率,表明MiR-21参与癫痫的发生发展。(2)SOX7 3’ UTR中有明确的miR-21结合位点,受miR-21的调控。第二部分MiR-21及SOX7对TLE大鼠海马中Wnt-β-catenin通路的影响目的:使用 miR-21 agomir(4 nmol/只)及 miR-21 antagomir(4 nmol/只)干预大鼠双侧海马,利用westernblot、免疫组化、尼氏染色、Bielschowsky银染、DSI体内信号遥测系统,研究大鼠海马内相关蛋白的分子生物学指标、病理改变以及脑电图的变化,探讨TLE大鼠海马中miR-21及其靶蛋白SOX7对Wnt-β-catenin信号通路的影响,阐明miR-21在TLE大鼠海马中的作用机制。方法:(1)选取4-6周雄性SD大鼠,体重(170±30)g,随机分为正常组(n=5)、miR-21 agomir 干预组(亚组:1d 组、14d 组、28d 组,各组 n=5)和 miR-21 antagomir 干预组(亚组:1d 组、14d 组、28d 组,各组 n=5),Digital PCR检测各组大鼠海马中miR-21的表达改变。(2)选取4-6周雄性SD大鼠,体重(170±30)g,随机分为正常组(亚组:1d组、14d组、28d组,n=10)、癫痫组(亚组:1d组、14d组、28d组,各组n=10)、miR-21 agomir干预组(亚组:10d组、14d组、28d组,各组n=10)和miR-21 antagomir干预组(亚组:1d组、14d组、28d组,各组n=10),建模前使用 miR-21 agomir(4 nmol/只)及 miR-21 antagomir(4 nmol/只)干预大鼠海马,然后经腹腔予氯化锂和匹罗卡品注射,构建TLE动物模型。(3)Westernblot 和免疫组织化学法检测 SOX7、β-catenin、cyclin D1 和Wnt-3a在各组大鼠海马组织中的表达变化。(4)尼氏染色观察各组大鼠海马神经元的病理改变;Bielschowsky染色观察 28 天正常组、28 天 TLE 组、28 天 miR-21 agomir 组和 28 天 miR-21 antagomir组大鼠海马神经元轴突增殖变化。(5)选取4-6周雄性SD大鼠,体重(170±30)g,大鼠随机分为正常组、TLE 组、miR-21 agomir 组以及 miR-21 antagomir 组(n=5 只/组),建模前予miR-21 agomir(4 nmol/只)及 miR-21 antagomir(4 nmol/只)干预大鼠海马,同时植入DSI植入子后休养3天,经腹腔予氯化锂-匹罗卡品诱发癫痫,记录脑电图28天。结果:(1)经miR-21 agomir干预后,miR-21的表达在1天和14天显著增加(P<0.05);经miR-21 antagomir干预后,miR-21的表达在1天和14天显著减少(P<0.05)。(2)SOX7在TLE各组表达减少,其中14天和28天减少最显著(P<0.0001);经miR-21 agomir干预后,1天、14天及28天时SOX7表达较正常组显著减少(P<0.0001)。1天时,与TLE组相比SOX7表达明显减少(P<0.0001),14天及28天无明显差异(P>0.05);经miR-21 antagomir干预后,1天、14天及28天时SOX7表达较TLE组显著增加(P<0.0001)。与正常组相比,1天时SOX7表达明显增加(P<0.0001),14天及28天无明显差异(P>0.05);免疫组化结果示大鼠海马CA3与CA1区的SOX7表达与Westernblot一致,DG区各组间无显著差异(P>0.05)。(3)β-catenin与Cyclin D1在TLE各组表达增加,其中14天和28天增加最显著(P<0.05);经miR-21 agomir干预后,1天、14天及28天时β-catenin与Cyclinn D1表达较正常组显著增加(P<0.05)。1天时,与TLE组相比β-catenin与Cyclinn D1均表达增加(P<0.05),14天及28天无明显差异(P>0.05);经 miR-21 antagomir 干预后,1 天、14 天及 28 天时 β-catenin与Cyclinn D1表达较TLE组显著减少(P<0.05)。与正常组相比,1天时β-catenin与Cyclinn D1表达明显减少(P<0.05),14天及28天无明显差异(P>0.05);免疫组化结果示大鼠海马CA3与CA1区的β-catenin与Cyclinn D1表达与Westernblot一致,DG区各组间无显著差异(P>0.05)。(4)Wnt-3a在TLE各组表达增加,其中14天和28天增加最显著(P<0.001);经miR-21 agomir干预后,1天、14天及28天时Wnt-3a表达较正常组显著增加(P<0.0001)。1天时,与TLE组相比Wnt-3a表达明显增加(P<0.0001),14 天及 28 天无明显差异(P>0.05);经 miR-21 antagomir 干预后,1天、14天及28天时Wnt-3a表达较TLE组显著减少(P<0.0001)。与正常组相比,1天时Wnt-3a表达明显减少(P<0.01),14天及28天无明显差异(P>0.05);免疫组化结果示大鼠海马CA3、CA1与DG区的Wnt-3a表达与 Westernblot一致。(5)尼氏染色发现TLE组在14天及28天时大鼠神经元细胞结构明显改变,数目减少,尼氏小体减少,其中以CA1及CA3区神经元细胞的损伤最重;经miR-21 agomir干预发现,1天组大鼠即出现轻微神经元损伤迹象以及少量尼氏小体的减少,14天及28天时神经元损伤较TLE组更显著;经miR-21 antagomir干预发现,14天及28天时大鼠神经元尼氏小体减少不显著,神经元损伤较TLE组轻。(6)Bielschowsky染色发现TLE组可见DG、CA1和CA3区神经元纤维排列紊乱,轴突增粗,多见拖尾深染以及神经纤维缠结;经miR-21 agomir干预后,发现神经元纤维排列紊乱以及轴突增粗现象无改善,拖尾以及深染的轴突仍较多;经miR-21 antagomir干预后,发现神经元纤维排列紊乱以及轴突增粗现象减轻,拖尾以及深染的轴突减少。(7)TLE组较正常组的总棘波数、总棘波间隔时间以及平均棘波间隔时间均显著增加(P<0.0001);经miR-21 agomir干预后,总棘波数、总棘波间隔时间以及平均棘波间隔时间较正常组仍增加显著(P<0.0001);经miR-21 antagomir干预后,总棘波数、总棘波间隔时间以及平均棘波间隔时间较TLE组显著减少(P<0.05)。结论:(1)Wnt-3a在TLE大鼠海马中表达增加,miR-21调节Wnt-3a在大鼠海马中的表达。(2)MiR-21靶向SOX7增加β-catenin及Cyclin D1的表达参与癫痫发生。(3)激动miR-21促进大鼠海马神经元损伤,抑制miR-21减少大鼠海马神经元损伤。