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肺癌是全球死亡率最高的癌症,也是发生率最高的癌症之一。约75%的肺癌患者被确诊时已经处于中晚期。治疗肺癌的传统方案包括手术、放疗和化疗,其中化疗的使用最广泛,手术后也需要多次化疗进行辅助治疗,但化疗的效果并不令人满意,同时化疗会带来呕吐,脱发,体重减轻等多种副作用。因此,新颖高效的治疗方法亟待开发。白细胞介素12(Interleukin 12,IL-12)是一种促进炎性反应的细胞因子,发现之初被命名为自然杀伤细胞刺激因子(Natural killer cell stimulating factor,NKSF)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(Cytotoxic lymphocyte maturation factor,CLMF),后被正式命名为白细胞介素12。IL-12可以促进自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)和CD8阳性胸腺依赖淋巴细胞(CD8+T cells)的成熟,以及增强它们的细胞毒活性;IL-12还可以诱导机体产生一些细胞因子,主要为伽马干扰素(Interferon gama,IFN-y)。因此,研究者很早就关注到IL-12的抗肿瘤效应,也开展了很多研究。免疫与化疗结合形成免疫化疗技术,有望为肿瘤治疗提供新的方案。我们设想通过低剂量化疗杀死部分肿瘤细胞,再用IL-12激发体内免疫系统,进一步发挥免疫攻击作用,从而提高机体抗瘤效果。藉此原理,我们构建小鼠原位肺癌模型,经紫杉醇(PTX)联合顺铂(CDDP)处理,再用IL-12进行免疫刺激,取得以下较好结果:1.成功构建小鼠原位肺癌模型为了模拟人类肺癌的真实情况,我们放弃了肿瘤模型中常用的皮下移植瘤方法,选择建立原位肺癌模型。通过多次尝试和摸索,最终通过尾静脉注射CT26肿瘤细胞和胸膜内注射LLC肿瘤细胞的方法,成功建立了 2种不同的小鼠原位肺癌模型。接种肿瘤细胞20天后,解剖结果显示两种模型小鼠的肺脏表面均布满肿瘤结节,其中LLC肿瘤模型并发胸腔积液。两种模型小鼠的其它脏器均未见肿瘤结节。病理切片结果显示正常肺脏组织有肿瘤细胞浸润。我们构建的小鼠肺癌模型较好地模拟了肺癌的真实情况。2.IL-12展现出积极的肺癌治疗效果通过给予荷瘤小鼠不同的药物组合,我们发现给予PTX+CDDP+重组小鼠白细胞介素 12(recombinant mouse Interleukin-12,rmIL-12)或者仅给予 rmIL-12,可以使荷瘤小鼠的存活时间显著提高。通过病理切片技术,发现rmIL-12或PTX+CDDP+rmIL-12联合治疗组的肿瘤结节数明显减少。同时构建了稳定表达荧光素酶报告基因的肿瘤细胞系,利用动物活体成像的方法对荷瘤小鼠进行了成像观察。结果发现,与对照组相比,给予PTX+CDDP+rmIL-12联合治疗后小鼠肺脏肿瘤结节显著减少。3.IL-12可以激活免疫系统并迅速刺激NK细胞分泌IFN-γ我们发现给予rmIL-12的荷瘤小鼠脾脏有明显的肿大,而给予PTX+CDDP的荷瘤小鼠脾脏则有轻微的缩小,单个核细胞的计数结果显示给予rmIL-12的小鼠脾脏的单个核细胞有明显增多,而给予PTX+CDDP的小鼠脾脏的单个核细胞则有轻微减少。进一步发现给予rmIL-12的小鼠血清中有高水平的IFN-γ。用流式细胞术检测了 NK细胞和T细胞内IFN-y的表达情况后,发现rmIL-12快速激活了 NK细胞而不是T细胞,产生IFN-γ。综上,我们推断rmIL-12可以快速激活NK细胞分泌IFN-γ。4.NK细胞和IFN-γ对于IL-12发挥抗肿瘤效应至关重要NK 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞和 IFN-γ缺陷小鼠(Nfil3-/-,CD4-/-,CD8-/-,IFN-γ-/-)以及野生型小鼠(Wild-type,WT)分别进行荷瘤,再给予rmIL-12和溶媒对照。动物活体成像实验显示Nffl3-/-和IFN-γ-/-荷瘤鼠中肿瘤的生长速度明显快于WT、CD4-/-和CD8-/-荷瘤鼠。经过rmIL-12治疗后,WT小鼠中的肿瘤生长速度明显减缓,但对Nfi13-/-和IFN-γ-/-鼠的肿瘤生长速度没有影响。生存曲线结果分析也显示WT荷瘤鼠经过rmIL-12治疗后,生存时间有了显著延长,而Nfil3-/-和IFN-γ-/-荷瘤鼠经过rmIL-12治疗后生存时间没有明显延长。这些结果证明NK细胞和IFN-γ在IL-12的抗肿瘤效应中至关重要。5.IL-12诱导产生的IFN-γ抑制了肿瘤的血管生成IFN-γ-/-小鼠以及WT小鼠进行荷瘤后再给予rmIL-12、PTX+CDDP,以及溶媒对照。免疫荧光实验结果显示rmIL-12极大地抑制了 WT荷瘤鼠肺脏肿瘤中血管标记物CD31、CD105和VEGFR3的表达,而在IFN-γ-/-鼠中,即使给予rmIL-12也无法抑制CD31、CD105和VEGFR3的表达。PTX+CDDP治疗组的CD31、CD105和VEGFR3的表达不受抑制,甚至有一定程度的增加。以上结果证明了IL-12诱导产生的IFN-γ抑制肿瘤的血管生成。结论:IL-12与传统化疗药物联合使用,能诱导明显的抗肿瘤效应并延长患肺癌小鼠的生存时间。这种疗效的机制主要在于IL-12能迅速激活NK细胞产生IFN-γ,从而抑制肿瘤的血管生成。因此,我们的研究可能为寻找治疗肺癌的方案提供了新的线索。