研究背景及目的脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是指因各种致病因素(外伤、炎症、肿瘤等)引起脊髓损害,造成损害平面以下的脊髓神经功能(运动、感觉、括约肌及自主神经功能)障碍的一类疾病,致残率高。脊髓损伤严重影响了患者的生存质量,有超过50%的患者存在不同程度的下肢运动功能障碍。针对运动功能障碍,目前尚无有效的方法可以完全治愈,步行训练作为临床上常规的康复治疗措施,被认为能够在一定程度上促进脊髓损伤患者下肢运动功能的恢复。在众多实验研究当中,人们发现,步行训练可以通过改善脊髓损伤部位血供、减轻炎症反应、提高局部神经营养因子表达、刺激脊髓内部神经网络结构激活重塑等途径促进实验动物后肢运动功能改善。步行中枢模式发生器(central pattern generator, CPG)是存在于脊髓低位胸段(T11-T13)及所有腰段(L1-L6)内的一种脊髓内固有的中间神经元网络结构,由相互支配联系的兴奋性中间神经元和抑制性中间神经元构成。CPG接受来自中脑运动区(mesencephalic locomotor region,MLR)的运动指令,执行步行动作的启动和发生。步行CPG具有训练依赖可塑性,即使完全失去上位中枢的控制,如果接受了特定参数的持续刺激,CPG内的兴奋性和抑制性中间神经元能够自激生成电活动,产生稳健的相位依赖性振荡信号,另外,CPG整合来自皮肤和肌肉的感觉传入信息,最终输出协调的节律活动步行模式。CPG中兴奋性中间神经元合成的神经递质主要包括谷氨酸、去甲肾上腺素、多巴胺等,这些兴奋性中间神经元在CPG自激启动、维持和协调节律的过程中均扮演重要角色,但目前尚没有对上述三类兴奋性中间神经元进行同期的比较观察,故无法确定究竟何种兴奋性中间神经元的激活在步行CPG中处于核心地位。小动物PET/CT(micro-PET/CT)是将正电子发射型电子计算机断层显像技术(PET)和X射线计算机断层成像技术(CT)结合的影像学检查手段,在基础研究中主要用于观察实验动物肿瘤、心血管系统等高代谢组织的变化。脊髓作为中枢神经系统的一部分,其主要的能量来源也是葡萄糖,目前已有实验研究利用micro-PET/CT观察到了在不同干预条件下小动物脊髓的局部代谢变化。故本研究拟结合18F-FDG-micro-PET/CT观察SCI大鼠腰段脊髓的代谢程度从而推断CPG在脊髓受损及步行训练刺激的条件下能否激活。本课题取T10节段不完全脊髓损伤大鼠模型,对其进行6周的跑台步行训练干预。通过定期评价三组大鼠BBB行为学评分,观察大鼠腓肠肌运动终板的数量及形态学变化,采用18F-FDG-Micro PET/CT、尼式染色及免疫荧光染色观察大鼠脊髓腰段CPG的代谢水平和谷氨酸能、去甲肾上腺素能、多巴胺能兴奋性神经元功能状态,分别从行为学、组织学、免疫化学、代谢等方面系统观察步行训练对SCI大鼠腰段步行CPG的影响,并探索CPG内优势中间神经元成份,为寻找新的有效的脊髓损伤康复策略提供新的思路。方法1.研究对象：SD大鼠45只,随机分为步行训练组(n=15)、损伤对照组(n=15)、假手术组(只打开椎板,不造成脊髓损伤)(n=15)；脊髓损伤组采用NYU法建立中度T10不完全脊髓损伤模型。2.研究方法造模分组后,对步行训练组按预设方案进行干预,对照组和假手术组常规饲养,不进行任何干预；定期观察各组大鼠BBB评分,术后7周利用micro-PET/CT扫描观察各组大鼠CPG代谢水平,取材后行免疫荧光染色、尼式染色观察步行CPG中间神经元数量和表达,利用乙酰胆碱酯酶染色观察腓肠肌运动终板的表达。(1)干预方法：步行训练组大鼠在伤后1周开始进行为期6周的跑台步行训练,训练方法为每天30分钟,分2次进行,每次15分钟,每周训练5天,休息2天,初始速度设置为5m/min。随后,根据大鼠恢复情况,逐渐提高跑台速度至15m/min。训练期间每天观察大鼠精神状态、进食进水量。(2)取材：腓肠肌新鲜取材及切片：在术后7周,完整取下大鼠右侧小腿三头肌,置于-80℃冰箱快速冷冻。1h后取出标本,进行常规冰冻序列切片,每5片取一片组织切片,标本厚度为10mm；大鼠灌注、脊髓取材及切片：在术后7周经大鼠左心室利用生理盐水及4%多聚甲醛灌注大鼠,直至大鼠躯干及四肢发白僵硬。定位大鼠脊髓的腰1-2节段并完整取出。按常规进行组织标本固定、脱水及包埋。沿脊髓冠状位进行常规冰冻序列切片,每5片取一片组织切片,切片厚度分为10μm及20μm。所有组织切片放置在密闭片盒中,-80℃冰箱保存。(3)观察指标与方法：1)行为学评定：采用双人双盲法评价三组大鼠术前及术后第7、14、21、28、35、42天的Basso, Beattie and Bresnahan(BBB)评分。2)CPG代谢水平：18F-FDG-micro-PET/CT扫描,步行训练结束后,每组随机选取5只大鼠进行micro-PET/CT扫描。称量大鼠体重,按37kBq (1 μ Ci)/g剂量经尾静脉注射18F氟-2-脱氧葡萄糖(18F-fluoro-2-deoxyglucose, 18F-FDG),在核素注射40分钟后将大鼠固定于俯卧位,进行大鼠脊髓全长PET/CT扫描。在L1-2节段相应横断面、冠状面及矢状面精确描画所需范围(regional of interest, ROI),利用Inveon research workplace 4.1软件计算ROI区域的每克组织百分注射剂量率IDO (%ID/g)。比较三组大鼠腰1-2节段脊髓组织对18F-FDG的摄取差异。3)L1-2脊髓总体神经元数量：尼氏染色,取各组腰段脊髓冰冻切片进行焦油紫染色、脱水、透明后,中性树胶封片。在100倍镜下随机选取5个视野,计数三组大鼠腰段脊髓灰质第Ⅶ、Ⅷ及X板层中间神经元总数量。4)L1-2脊髓三类兴奋性中间神经元数量及表达：免疫荧光染色,根据所染目标神经元将三组大鼠腰段脊髓切片均分别编号A、B、C。①谷氨酸能中间神经元：取各组腰段A号冰冻切片,复温1h,利用0.3%TritonX-100破膜30min后每张载玻片上滴加200ul10%封闭山羊血清孵育1h。吸去封闭血清后直接滴加小鼠抗NeuN(1:100)及兔抗GS(1：100)一抗稀释液4℃过夜,漂洗后每张载玻片上滴加200ul山羊抗兔(1：200)及山羊抗小鼠(1：200)二抗混合稀释液37℃孵育1h。漂洗后每张载玻片滴加200ulDAPI工作液,避光孵育5min。最后,防淬灭封片剂封片。②去甲肾上腺素能中间神经元：取各组腰段B号冰冻切片,方法同上,所用一抗为：小鼠抗NeuN(1:100)及兔抗DBH(1：100),二抗同上。③多巴胺能中间神经元：取各组腰段C号冰冻切片,方法同上,所用一抗为：小鼠抗NeuN(1:100)及兔抗TH(1：100),二抗同上。④共聚焦激光扫描显微镜扫描拍照,100倍镜下随机选取5处视野,利用Image Pro Plus6.0软件计数脊髓灰质第Ⅶ、Ⅷ及Ⅹ板层各类中间神经元的数量,600倍镜下随机选取5处视野,利用Image Pro Plus6.0软件计脊髓灰质第Ⅶ、Ⅷ及Ⅹ板层三类目标中间神经元的平均荧光强度,用灰度值表示。5)腓肠肌运动终板表达：采用乙酰胆碱酯酶染色法对腓肠肌运动终板进行染色。对大鼠腓肠肌行新鲜低温冰冻切片后将切片置入孵育液内,37℃孵育1.5h,观察切片颜色变为淡棕色即可。取出切片,蒸馏水冲洗5min。将切片置入苏木精染液内,室温染色1-2min,至肌肉细胞核呈淡紫色即可。立即用蒸馏水冲洗去苏木精染液。擦去水分,中性树胶封片。100倍镜下随机选取5个视野,利用Image Pro Plus6.0软件计数各组运动终板总数及平均光密度值。(4)统计学方法：所有数据均采用均数±标准差(x±s)表示。采用统计软件SPSS19.0进行数据分析,多组间样本比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),存在组间差异时,方差齐时两两比较采用LSD法,方差不齐时则采用方差不齐的近似F检验Welch法,两两比较采用Dunnett’s T3法进行组间比较,双变量相关分析采用Spearman相关分析法,BBB评分与多变量间的相关性分析采用多元线性回归分析。以P<0.05判断差异具有统计学意义。结果1.BBB评分：Sham组大鼠在麻醉完全清醒后已基本可以正常行走,在术后第1天便恢复至术前运动状态,BBB评分均在20-21分。SCI大鼠术后早期,后肢运动功能严重受限,BBB评分在0-1分。在脊髓损伤后2周,步行训练组大鼠已间断出现双下肢髋、膝、踝三关节的活动,BBB评分为5.67±1.03分,明显高于对照组评分(P<0.05)。损伤对照组大鼠在伤后2周,偶尔可见髋或膝关节的活动,BBB评分为2.83±0.75分。随时间进展,步行训练组大鼠的后肢运动功能恢复速度较快,在各时间点的BBB评分结果均优于损伤对照组大鼠(P<0.05)。到术后49天时,步行训练组大鼠已能够在步行时脚掌持续负重且前后肢动作协调,BBB评分平均达到16.08±0.80分,明显高于损伤对照组14.08±0.66分(P<0.05)。2.CPG代谢水平伤后50天,micro-PET/CT结果显示,损伤对照组大鼠腰段ROI核素平均摄取值为0.145±0.081%ID/g,与Sham组大鼠腰段ROI核素平均摄取值0.139±0.026%ID/g相比无明显统计学差异(P>0.05),步行训练组大鼠腰段ROI核素平均摄取值为0.284±0.053%ID/g,显著高于损伤对照组及Sham组。对损伤对照组及步行训练组大鼠腰段CPG18F-FDG平均摄取值与BBB评分进行相关分析,发现不同干预手段下脊髓损伤大鼠腰段CPG18F-FDG平均摄取值与BBB评分之间存在显著相关关系,即对SCI大鼠进行步行训练,其后肢的运动功能可随着腰段CPG代谢活动增强而提高。3.L1-2脊髓总体神经元数量损伤对照组(94.2±9.86个/视野)大鼠中间神经元数量与Sham组(123.2±11.00个/视野)相比减少(P<0.05),采用步行训练进行干预可以维持CPG中间神经元的数量(131.2±10.03个/视野),与损伤对照组相比有统计学差异(P<0.05),与Sham组相比无统计学差异(P>0.05)。4.L1-2脊髓三类兴奋性中间神经元数量及表达谷氨酸能中间神经元：计数：Sham组步行CPG内谷氨酸能INs计数118.67±2.30个/视野,损伤对照组步行CPG内谷氨酸能INs计数118.80±4.21个/视野,与Sham组相比无明显统计学意义(P>0.05),训练组步行CPG内谷氨酸能INs数量明显增多,达到135.80±6.46个/视野,显著高于Sham组与损伤对照组(P<0.05)。平均荧光强度:Sham组步行CPG内谷氨酸能INs的MFI为0.0780±0.0172,脊髓损伤大鼠腰段CPG内谷氨酸能INs的MFI出现增多,达0.1975±0.0193,显著高于Sham组且有统计学差异(P<0.05),6周步行训练后谷氨酸能INs的MFI出现进一步升高,达0.3559±0.0027,显著高于损伤对照组及Sham组(P0.05)。去甲肾上腺素能INs：计数：Sham组步行CPG内去甲肾上腺素能INs计数83.80±4.71个/视野,损伤对照组步行CPG内去甲肾上腺素能INs计数为83.60±5.22个/视野,与Sham组相比无明显统计学意义(P>0.05),训练组大鼠步行CPG内去甲肾上腺素能INs计数89.60±3.21个/视野,与Sham组与损伤对照组对比无统计学差异(P>0.05)。平均荧光强度：Sham组步行CPG内去甲肾上腺素能INs的MFI为0.1120±0.0236,在损伤对照组大鼠腰段CPG内去甲肾上腺素能INs的MFI,升高至0.1588±0.0114,显著高于Sham组且有统计学差异(P<0.05),6周步行训练后,去甲肾上腺素能INs的MFI进一步升高至0.3172±0.0165,显著高于损伤对照组及Sham组(P<0.05)。多巴胺能INs：计数：Sham组步行CPG内多巴胺能INs计数为81.00±5.34个/视野,损伤对照组步行CPG内多巴胺能INs计数为80.20±4.66个/视野,与Sham组相比无明显统计学意义(侈岔05),训练组大鼠步行CPG内多巴胺能INs计数86.20±3.27个/视野,与Sham组与损伤对照组对比无统计学差异(P>0.05)。平均荧光强度：Sham组步行CPG内多巴胺能INs的MFI为0.0564±0.0060,损伤对照组步行CPG内多巴胺能INs的MFI升高至0.1466±0.0296,显著高于Sham组且有统计学差异(P<0.05),6周步行训练后多巴胺能INs的MFI进一步升高至0.2134±0.0257,显著高于损伤对照组及Sham组(P>0.05)。5.腰段谷氨酸能、去甲肾上腺素能、多巴胺能神经元表达与BBB评分相关性以三类兴奋性INs的计数、MFI这6个指标作为自变量,以BBB评分作为应变量,进行逐步线性回归分析(a入=0.05,a出=0.10)。经分析,方程有统计学意义(F=107.646,P=0.000),决定系数R2=0.931,调整R2=0.922,自变量谷氨酸能INs计数进入方程,即为分析所得的影响BBB评分的主要因素。谷氨酸能INs计数与BBB评分呈正相关,即随着谷氨酸能INs数量的增多,BBB评分增高。6.腓肠肌运动终板数量及表达Sham组大鼠腓肠肌运动终板呈深棕色,椭圆形,形态规整,多呈弧线形排列于腓肠肌长轴双侧中外1/3处。步行训练组大鼠腓肠肌运动终板形态、着色程度、排列方式与Sham组类似,计数(17.6±5.1个/视野)与Sham组(16.0±4.5个/视野)无明显统计学差异(P>0.05)。损伤对照组大鼠腓肠肌的运动终板周围为较浅的棕色,中央近乎透明,同样呈椭圆形但面积小,呈较为松散的弧线形排列,位置与Sham组类似,计数(8.8±1.6个/视野)与Sham组及步行训练组相比均明显减少(P<0.05)。通过目标区域平均光密度对各组切片的运动终板着色程度进行分析,发现步行训练组大鼠腓肠肌运动终板着色程度(0.5642±0.0075)与Sham组(0.5872±0.0491)相似(P>0.05),且均高于损伤对照组(0.4220±0.4050)(P<0.05)。对大鼠运动终板数量、光密度值与BBB评分进行相关分析,发现不同干预手段下脊髓损伤大鼠运动终板的数量及光密度值与BBB评分之间存在显著相关关系,即对SCI大鼠进行步行训练,其后肢的运动功能可随着运动终板数量的恢复及乙酰胆碱酯酶浓度和活性的增高而提高。结论1.步行训练能有效促进SCI大鼠后肢运动功能的恢复,促进谷氨酸能、去甲肾上腺素能、多巴胺能中间神经元表达,改善CPG代谢,提高腓肠肌运动终板数量和表达。2.脊髓谷氨酸能神经元作为主要的兴奋性中间神经元参与CPG的步行节律形成。3.步行训练通过增强谷氨酸能、去甲肾上腺素能、多巴胺能中间神经元可塑性,提高腓肠肌运动终板数量和表达促进脊髓损伤模型大鼠后肢运动功能恢复。