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脓毒症是指机体感染微生物后发生的全身炎性反应综合征,是ICU危重病人死亡重要原因之一。Toll样受体4(Toll like receptor4, TLR4)相关信号通路在炎症反应中起了举足轻重的作用,因此其功能上的缺陷可能严重影响机体抵抗炎症的免疫反应。TLR4通过病原体相关分子模式(PAMPs)识别病原体微生物,激活并启动细胞内信号转导通路,诱导天然免疫的产生,是脓毒症发生发展的重要病理生理机制。基于目前研究进展,本课题重点开展了两方面的系统研究：1.利用生物信息学和基因克隆技术,探讨了TLR4基因编码区发生自然突变的非同义SNPs对LPS刺激的反应,旨在为揭示TLR4基因多态性与脓毒症易感性的相关研究提供分子生物学基础。2.利用分子生物学技术,探讨一个新的蛋白恶性纤维性组织细胞瘤扩增顺序1(MFHAS1)在LPS/TLR4信号通路中的功能作用,旨在为脓毒症的标靶治疗提供新的思路。主要研究结果如下：1.利用生物信息学,筛选出人TLR4基因编码区发生自然突变的非同义单核苷酸位点(SNPs)17个,其中胞外区14个,胞内区3个。通过PCR及点突变技术成功构建pEGFP-huTLR4质粒及相关17个自然突变质粒。使用LPS刺激后使用双荧光素酶法检测下游NF-κB报告基因活性,结果显示其中A896G, C1196T,A2081G三个SNPs位点的NF-κB报告基因活性明显降低,而其他SNPs位点NF-κB活性无明显差异。其后使用实时荧光定量PCR方法检测此三个SNP位点下游炎性因子TNF-α、IL-6mRNA表达量均明显降低,进一步验证了该三个SNP位点功能正常与否可影响TLR4信号通路的传递。2.通过实时荧光定量PCR方法,检测发现TLR4基因敲除小鼠的单核巨噬细胞中MFHAS1的表达明显低于野生型小鼠。其后进一步通过RNA干扰技术沉默野生型小鼠单核巨噬细胞中的MFHAS1mRNA表达,使用LPS刺激小鼠单核巨噬细胞后发现,TLR4信号通路中下游的pP65、pP38、pJUN、pERK均明显升高,同时下游TNF-a、IL-6、IL-12的表达明显上升,因此可以认为MFHAS1在TLR4信号通路中可能起负调控作用。本课题通过不同方法和角度研究单核巨噬细胞中TLR4介导的天然免疫反应相关信号通路时不同环节变化的机制,结果表明：(1)TLR4基因的三个突变位点A896G.C1196T、A2081G是脓毒症发生易感性的重要分子生物学基础；(2)在TLR4信号通路中MFHAS1可能起负调控作用。