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干扰素是人和其他动物体内十分重要的一种细胞因子。在适当诱导物的作用下,由效应细胞生成并分泌,具有广谱抗病毒活性、抗肿瘤活性和调节免疫功能。干扰素主要包括三大类,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,IFN-a属于Ⅰ型干扰素,是由白细胞受特定的抗原刺激后产生的一类糖蛋白,具有一定的种属特异性。IFN-α因具有广谱抗病毒活性,所以在实验研究和临床应用方面具有很高的价值。本课题研究了犬的干扰素0α,并对CaIFN-α4和CaIFN-α2的基因进行部分改造,在不同的表达系统中进行了表达和抗病毒活性的分析。试验一:犬干扰素α4在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性分析为制备表达量高、具有生物活性的犬干扰素0α,将密码子针对大肠杆菌优化后的犬干扰素α4(CaIFN-α4)成熟蛋白的目的基因与pET28a载体连接,构建原核表达载体pET-28a-CaIFN-α4。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中,经过IPTG诱导,获得大小约为23kDa的CaIFN-α4重组蛋白,通过超声破碎,获得干扰素包涵体,包涵体通过尿素变性,透析复性后,利用组氨酸标签蛋白纯化方法获得纯化的CaIFN-α4,在MDCK与MDBK细胞上检测纯化后的样品具有抗水疱性口炎病毒(VSV)活性,活性分别为1.19×105U/mL和1.86×103U/mL。本研究成功地利用大肠杆菌Rosetta表达了具有抗病毒活性的CaIFN-α4,为进一步研制高活性的CaIFN-α4的生产系统奠定了实验基础。试验二:犬干扰素α4在CHO中的稳定表达及抗病毒活性分析为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽(2G4S)柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pL-eGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其它三种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev,pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现荧光,用MDCK与MDBK细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒(VSV)活性,活性分别为1.39×l05U/mL和2.19×104U/mL。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了实验基础。试验三:犬干扰素α2的在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性分析为制备表达量高、具有生物活性的犬干扰素α,将密码子针对大肠杆菌优化后的犬干扰素α2(CaIFN-α2)成熟目的基因与pET28a载体连接,构建原核表达载体pET28a-CaIFN-α2,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta中,经过IPTG诱导,获得大小约为23kDa的CaIFN-α2重组蛋白,通过超声破碎,获得干扰素包涵体,包涵体经过尿素变性,透析复性后,利用HisTrap亲和层析纯化方法获得纯化的CaIFN-α2,在MDCK与MDBK细胞上检测纯化后的样品具有抗水疱性口炎病毒(VSV)活性,活性分别为1.70× 1 06U/mL和3.16× 1 03U/mL。本研究成功地利用大肠杆菌Rosetta表达了具有较高活性的CaIFN-α2,为进一步研制CaIFN-α2的生产系统奠定了实验基础。