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研究背景结肠癌（Colon Cancer,CLC）为一种常见于消化系统的恶性肿瘤,根据2020年全球最新癌症负担数据,结肠癌的发病率和死亡率在世界范围和我国均居高不下。此外,转移性结肠癌患者的预后很差,对人类身体健康造成严重威胁。结肠癌的发病机制错综复杂,至今尚不完全明确。近年来随着研究的不断深入,新型治疗方案不断出现,结肠癌患者的中位生存期虽有一定延长,但总体预后仍不理想。因此,对结肠癌发生发展的分子机制进行深入研究,寻找新的治疗靶点是非常必要的。前蛋白转化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9）为前蛋白转化酶家族的一员,目前被广泛认为是低密度脂蛋白代谢的关键调节因子,参与体内血脂代谢的调节和胆固醇稳态的维持。值得注意的是,PCSK9不仅与血脂代谢有关,还参与其他多个生物过程,包括细胞周期、炎症、细胞凋亡和病毒感染等。近年来,随着对胆固醇代谢与肿瘤关系研究的不断深入,研究者们开始把目光放在了 PCSK9在癌症发生和进展中的作用。有多项研究指出,PCSK9在肝细胞癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中可能具有一定的调控作用,与癌症发生风险和患者预后有关。但是,这些关于PCSK9与肿瘤关系的研究尚存在争议,此外关于PCSK9在结肠癌中的研究较少,而且这些研究大多数是基于临床前研究,因此需要更深入的研究来阐明PCSK9在结肠癌中的作用及其分子机制。实验方法1、免疫组化法检测PCSK9在30例人结肠癌组织及相应癌旁邻近组织和远端组织中的表达,并分析PCSK9表达与临床病理参数的相关性。2、分别利用siRNA瞬时转染和质粒转染技术下调和上调人结肠癌细胞内PCSK9的表达,利用western blot检测PCSK9的表达水平;然后利用CCK8增殖实验、划痕实验、Transwell迁移实验和Transwell侵袭实验检测PCSK9表达变化对结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。3、利用western blot技术检测上调和下调PCSK9后人结肠癌细胞内EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin、MMP9和Snail 1的蛋白表达,研究PCSK9对结肠癌细胞EMT过程的调控作用。4、利用western blot实验检测上调和下调PCSK9后PI3K/AKT信号通路蛋白的表达,研究PCSK9对PI3K/AKT信号通路的调节作用。5、利用蛋白质组学分析下调PCSK9前后HCT116细胞内各种功能蛋白的变化情况,统计分析差异蛋白并利用western blot进行验证以寻找下游靶点。6、建立结肠癌细胞与巨噬细胞共培养体系,并利用qRT-PCR、western blot、流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2标记物的表达,以研究PCSK9对TAMs表型极化的影响。7、稳定沉默PCSK9的结肠癌细胞株通过感染慢病毒构建,并利用裸鼠建立结肠癌尾静脉-肺转移模型和腋窝皮下成瘤模型,5-6周后处死小鼠观察肿瘤大小和肺转移情况。实验结果1、PCSK9在人结肠癌组织中高表达,且PCSK9表达与肿瘤病理分级有关,病理分级程度高的患者更容易出现高表达。2、下调结肠癌细胞内PCSK9抑制细胞的体外增殖、迁移和侵袭;上调结肠癌细胞内PCSK9促进细胞的体外增殖、迁移和侵袭。3、下调结肠癌细胞内PCSK9后,上皮细胞标记物E-cadherin表达上调而转录因子Snaill、间质标记物N-cadherin、基质金属蛋白酶MMP-9表达下调;相反,上调结肠癌细胞内PCSK9后,E-cadherin表达下调,Snail 1、N-cadherin、MMP-9蛋白表达水平升高。4、下调结肠癌细胞内PCSK9后,p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平明显下降,而总AKT表达没有发生明显改变;上调结肠癌细胞内PCSK9,p-PI3K和p-AKT表达升高,AKT表达水平基本不变。5、蛋白质组学分析提示PCSK9与结肠癌细胞代谢过程、免疫调节密切相关,改变胞内PCSK9后,乳酸化修饰蛋白和MIF的表达水平发生变化。6、敲低PCSK9的结肠癌细胞与巨噬细胞共培养48h,qRT-PCR结果显示M1型标志分子IL-6、IL-1A、IL-1B、CXCL9、CD64、TNF-α的表达水平上升,M2型标志分子IL-10、IL-13、Arg-1、TGF-β的表达水平明显降低;Western blot结果显示M1标记物iNOS表达上调而M2标记物CD163表达下调;流式细胞术结果显示巨噬细胞M1型标记物CD86的阳性表达率明显提高。7、体内结果显示,沉默PCSK9后,裸鼠肺表面可见转移灶数目明显减少;H＆E染色结果也显示与NC组相比,沉默PCSK9组裸鼠的肝、肺病理损伤减轻。实验结论本研究从临床标本、体外细胞实验和体内动物实验较为完整地研究了 PCSK9在结肠癌发展中的作用。本研究表明:PCSK9在结肠癌患者癌组织中存在高表达,且PCSK9表达水平与肿瘤病理分级有关;PCSK9促进了结肠癌细胞的体外生长、侵袭和转移,其机制可能是通过调控EMT和激活PI3K/AKT信号通路实现的;PCSK9可能参与调控结肠癌细胞的乳酸代谢过程和MIF的表达,并且促进TAMs向M2极化,抑制抗肿瘤免疫;此外,PCSK9还可以促进结肠癌的体内转移。