【摘 要】
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纤维素(cellulose)是一种基本结构为葡萄糖的大分子多糖,其广泛的存在于自然界中,是植物细胞壁的主要组成成分,同时也是地球上最丰富的可再生能源之一。然而,降解纤维素的传统方法是利用糖苷水解酶系来对其进行水解,由于纤维素的晶体结构使得纤维素难以降解,限制了糖苷水解酶的催化效率,就使得自然界中的生物能源不能被最大程度的有效利用。因此如何高效利用生物能源是我们首要需要解决的问题,对于解决目前世界上
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纤维素(cellulose)是一种基本结构为葡萄糖的大分子多糖,其广泛的存在于自然界中,是植物细胞壁的主要组成成分,同时也是地球上最丰富的可再生能源之一。然而,降解纤维素的传统方法是利用糖苷水解酶系来对其进行水解,由于纤维素的晶体结构使得纤维素难以降解,限制了糖苷水解酶的催化效率,就使得自然界中的生物能源不能被最大程度的有效利用。因此如何高效利用生物能源是我们首要需要解决的问题,对于解决目前世界上资源短缺和环境污染等问题有积极的作用。基于近年来的研究,发现了裂解多糖单加氧酶(Lytic Polysaccharide Monooxygenases,LPMO)能够有助于更加高效快速地降解结晶多糖。裂解多糖单加氧酶是一类在二价金属离子和还原剂存在的情况下,能够通过氧化作用裂解纤维素糖苷键断裂的氧化酶,从而使得底物的结构更加松散,有助于下一步更加彻底的水解。LPMO主要包括辅助活性9家族(AA9,auxiliary activities 9)和辅助活性10家族(AA10,auxiliary activities 10),其中来源于AA9家族的LPMO只对纤维素具有特异性,而来源于AA10家族的LPMO绝大多数对几丁质具有特异性,只有少部分对纤维素具有特异性。目前,对于LPMO的研究仍有许多问题,例如如何提高LPMO的表达量,如何更加高效、环保地生产出在医疗、食品等方面都具有应用价值的寡糖物质等问题都有待解决。因此,研究和开发新来源的LPMO对于结晶多糖的高效降解和生物再利用具有重要的现实意义。本文通过合成黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)lpmo基因,构建了p PICZαA-Pclpmo表达载体,电转毕赤酵母GS115实现了分泌表达,重组蛋白表达量为450 mg/l。以微晶纤维素为底物,分析了重组Pc LPMO的最适作用温度与p H,其最适作用温度为60℃,最适p H为6.0。重组Pc PLMO对碱预处理的秸秆纤维活性较高,为23.3 U/ml。Pc PLMO具有较好的热稳定性,分别在80℃、90℃与100℃保温60 min,残留活性为80%、62%与48%。经Endo H脱糖基化分析,Pc LPMO发生了高度糖基化修饰,从而促进了酶的高温热稳定。Pc LPMO与纤维素酶共同水解秸秆底物表现出了一定的协同作用。单一纤维素酶和Pc LPMO(20U/g)与纤维素酶协同分别水解玉米秸秆、小麦秸秆、大豆秸秆时,表现出的酶活性分别为20.3 U/ml、21.7 U/ml、20.8 U/ml和24.9U/ml、25.5 U/ml、26.4U/ml。当整个反应体系中加入Cu2+后,Pc LPMO(20U/g)与纤维素酶共同作用于玉米秸秆、小麦秸秆、大豆秸秆时,表现出的酶活性分别为32.7 U/ml、34.2 U/ml、34.3U/ml,说明了Pc LPMO结构中有铜离子结合位点,能够提高纤维素酶活性。相关结果可为LPMO协同纤维素酶降解纤维素的应用提供参考价值。
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