细胞融合又称为细胞杂交,是指两个或两个以上的亲代细胞通过发生胞膜融合形成一个子代细胞的现象。细胞融合能够促进肿瘤细胞发生侵袭,进而实现远处转移。研究表明,促融合蛋白在细胞融合过程中起着非常重要的作用。作为促融合蛋白家族的重要成员,合胞素(syncytin-1)在多种肿瘤组织中高表达,并且已被证实参与了多种肿瘤细胞(乳腺癌、绒毛膜癌、肺癌等)与体细胞的融合过程。然而,syncytin-1对细胞融合的调控作用及机制目前尚不清楚。肿瘤炎症微环境与肿瘤的进展密切相关。目前研究证实,炎症因子如TNF-α能够招募人多功能干细胞、间充质干细胞以及造血系统干细胞等,通过不同细胞间的融合,从而实现创口的愈合。另外,在炎症因子的刺激下,细胞融合的发生率显著增加;炎症细胞(如巨噬细胞、白细胞、树突状细胞等)能够通过与肿瘤细胞(如乳腺癌、肺癌、肝癌等)发生融合,进而促进肿瘤发生远处转移。然而,目前关于炎症因子对细胞融合调控作用的研究较少,而其中所涉及的分子调控机制及潜在作用研究尚未见相关报道。本研究通过观察炎症因子TNF-α对口腔鳞癌细胞与脐静脉内皮细胞融合的影响,检测TNF-α/syncytin-1对细胞融合的调控作用及其分子机制,旨在探究炎症微环境促进肿瘤细胞与体细胞融合的一种新机制。第一部分TNF-α[在SCC-9与HUVEC自发融合过程中的调控作用目的:探讨炎症刺激因子TNF-α对鳞癌细胞与脐静脉内皮细胞融合的调控作用,以及分析融合细胞的形态和特点。方法:利用慢病毒载体将鳞癌细胞SCC-9及脐静脉内皮细胞HUVEC分别转染红色荧光蛋白(RFP)及绿色荧光蛋白(GFP)。待转染72小时后,通过流式细胞荧光分选技术(FACS)筛选出荧光强度较为稳定的细胞;然后将等量的RFP标记的 SCC-9(RFP-SCC-9)及 GFP 标记的 HUVEC(GFP-HUVEC)共培养,利用普通荧光显微镜(FM)观察细胞融合情况,细胞核数目以及胞核间距等;将细胞核利用DAPI染色后,利用激光扫描共聚焦荧光显微镜(LSCM)观察融合细胞形态。将10ng/m1TNF-α加入共培养体系,连续观察。分别在第1、3、7天,随机选取三个视野,利用人工计数法(Artificial Cell Counting)分别计算出实验组及对照组融合细胞的数目;在共培养第14天,利用流式细胞仪技术(FACS),计算出两组共培养体系的细胞融合率,从而探究TNF-α对SCC-9与HUVEC细胞融合的影响。结果:1.FM观察结果显示:SCC-9与HUVEC能够发生自发融合,融合细胞呈现接色荧光,且荧光强度较为稳定;其形态不规则,大小较亲代细胞无明显差异;融合细胞中细胞核的数目不等,大部分含1～2个胞核,3个或以上者较少;核间距也不尽相同,部分融合细胞内胞核相距较远,可清晰分辨出完整胞核形态,另外一部分胞核则较近,甚至已经融合成一个完整的子代胞核;融合细胞能够稳定存在共培养体系中7～8周。2.LSCM观察结果显示:融合细胞胞膜完整,无皱缩及发泡现象;核膜完整,细胞核无固缩现象。3.人工计数法结果表明:两组共培养体系中融合细胞数目都随着时间的变化而増加;而实验组的融合细胞数目明显多于对照组,约为2～3倍(2.18±0.32)(P<0.01)。4.FACS实验结果显示:实验组细胞融合率为1.78±0.053%,而对照组融合率为0.748±0.024%。两组实验结果具有明显的统计学差异(P<0.01)。结论:综合FM,LSCM,人工计数法与FACS分析结果,证实鳞癌细胞SCC-9与脐静脉内皮细胞HUVEC能够发生自发融合。融合细胞形态、细胞核数目及核间距各不相同,且融合细胞能够稳定存在于共培养体系中,不会发生明显的细胞凋亡现象;而炎症刺激因子TNF-α能够明显促进SCC-9和HUVEC的融合,使两者的融合率显著增加。第二部分Syncytin-1在TNF-α促进SCC-9与HUVEC融合过程中的作用目的:探讨促融合蛋白syncytin-1在TNF-α促进SCC-9与HUVEC融合中的潜在作用,重点关注TNF-α与syncytin-1、syncytin-1与细胞融合过程中的交互对话。方法:利用免疫组化(IHC)的方法,检测口腔鳞癌组织中syncytin-1的表达;再利用蛋白质免疫印迹(Western Blot)的方法,检测SCC-9及HUVEC中syncytin-1及其受体ASCT-2的表达;同时,将SCC-9与HUVEC分别单独培养,加入10ng/ml TNF-α后,分别于6、12、24小时检测syncytin-1及ASCT-2的蛋白表达量。利用慢病毒将SCC-9中的syncytin-1基因沉默形成稳定的sh-syncytin-1-SCC-9,然后将其与RFP-HUVEC以1:1比例共培养,连续观察7天,在第1、3、7天利用人工计数法计算融合细胞数目;于第14天利用FACS测量融合率。结果:1.IHC结果显示:在28例口腔鳞癌组织中,有26例检测到了 syncytin-1的表达,且syncytin-1主要集中于胞膜及胞浆部分;其中,22例检测到较高的表达量(4-7分),而其余6例则较弱(2例没有检测到表达)(0-3分)。Western Blot结果显示:syncytin-1在SCC-9中具有较强的表达,而在HUVEC中表达较弱;相反,ASCT-2则在HUVEC中强表达,在SCC-9中的表达量较低。2.加入TNF-α刺激后,连续观察24小时结果表明:相比于对照组,实验组中syncytin-1及ASCT-2的表达随着时间的变化明显增加,且两者的表达量在三个时间点均明显高于对照组(P<0.01)。3.将syncytin-1沉默后,利用人工计数法计算融合细胞数量。结果显示:两组中融合细胞数均随着时间的变化而增加,但实验组融合细胞数明显低于对照组(P<0.01)。FACS结果显示:实验组细胞融合率为0.196±0.008%,明显低于对照组0.768±0.012%,两者具有显著的统计学差异(PP<0.01)。结论:在口腔鳞癌组织和细胞中,syncytin-1表达量较高,而在HUVEC中,受体ASCT-2具有强表达;另外,两者均受到TNF-α的正相关调控作用;同时,将syncytin-1沉默后,融合细胞数明显减少,且细胞融合率显著降低,表明syncytin-1在SCC-9与HUVEC融合过程中具有重要的作用。充分说明TNF-α与syncytin-1、syncytin-1与细胞融合之间具有较为紧密的交互作用。第三部分Wnt/β-catenin信号通路在TNF-α促进SCC-9与HUVEC融合过程中的作用目的:探讨TNF-α促进SCC-9与HUVEC融合的潜在分子机制,重点关注Wnt/β-catenin信号通路在TNF-α调控syncytin-1过程中的作用,以及Wnt/β-catenin信号通路对SCC-9与HUVEC细胞融合的影响。方法:在SCC-9培养体系中分别加入TNF-α(10ng/ml),Wnt/β-catenin通路阻断剂DKK-1(100ng/ml),激活剂 Wnt3α(100ng/ml),分别于 6、12、24 小时提取蛋白,利用Western Blot检测不同时间点P-β-catenin(磷酸化β-catenin)、β-catenin以及syncytin-1的改变;利用慢病毒将SCC-9细胞中Wnt通路关键基因β-catenin进行沉默或过表达,形成sh-β-catenin-SCC-9及en-β-catenin-SCC-9稳定转染。然后将两者分别单独培养,加入TNF-α(l0ng/ml),分别于6、12、24小时提取蛋白,利用Western Blot检测不同时间点syncytin-1的改变。将RFP-SCC-9与GFP-HUVEC按照1:1的比例共培养,然后在共培养体系中分别加入 TNF-α(1Ong/ml),DKK-1(100ng/ml),Wnt3α(1OOng/ml),连续培养。分别在第1、3、7天采用人工计数法计算融合细胞数量;在第14天利用FACS测量细胞融合率;将sh-β-catenin-SCC-9及en-β-catenin-SCC-9分别与等量的RFP-HUVEC共培养,分别在第1、3、7天采用人工计数法计算融合细胞数量;在第14天利用FACS测量细胞融合率;结果:1.Western Blot结果显示:SCC-9加入TNF-α刺激后,在6、12、24小时三个时间点,实验组的P-β-catenin的表达量明显低于对照组,而β-catenin的量则显著高于对照组,并且syncytin-1表达量显著增加,与对照组具有明显的统计学差异(P<0.01);当 SCC-9 分别加入 Wnt3α 后,P-β-catenin、β-catenin以及syncytin-1三者表达量的变化趋势与TNF-α组类似,均为P-β-catenin减少,而β-catenin以及syncytin-1的量显著增加;相反,当加入DKK-1时,SCC-9中P-β-catenin的表达量随着时间的变化增加明显,而β-catenin以及syncytin-1的量则明显减少,与对照组具有明显的统计学差异(P<0.01)。将sh-β-catenin-SCC-9 及 en-β-catenin-SCC-9 分别利用 TNF-α 刺激后,Western Blot结果显示:实验组中syncytin-1的表达量明显高于对照组。2.人工计数法结果显示:加入TNF-α与Wnt3α后,实验组在第1、3、7天所计算获得的融合细胞数均显著高于对照组,而相反,加入DKK-1后,融合细胞数则明显减少;同时,当β-catenin过表达时,实验组融合细胞数显著增加,而当β-catenin沉默时,实验组融合数则明显减少。3.FACS结果显示:TNF-α组与Wnt3α组的细胞融合率分别为1.78±0.053%及1.76±0.07%,而DKK-1组细胞融合率则低至0.367±0.016%;另外,当β-catenin过表达时,SCC-9与HUVEC细胞融合率为1.80±0.033%,相反,当β-catenin沉默时,融合率则降至0.30±0.029%。结论:TNF-α能够通过激活SCC-9中Wnt/β-catenin信号通路,从而调控syncytin-1的改变;同时,Wnt/β-catenin信号通路能够部分调控SCC-9与HUVEC的细胞融合过程;Wnt/β-catenin信号通路与TNF-α、Wnt/β-catenin信号通路与细胞融合之间存在着密切的交互关系作用。综上所述,我们可以得知,症因子TNF-α能够促进SCC-9与HUVEC的融合;同时,TNF-α能够调控SCC-9中的syncytin-1及HUVEC中ASCT-2的表达,且 syncytin-1 与 SCC-9 与 HUVEC 的融合关系密切;TNF-α 与 Wnt/β-catenin 信号通路密切相关,且Wnt/β-catenin信号通路能够调控SCC-9与HUVEC的融合。这些结果表明:炎症因子TNF-α能够通过Wnt/β-catenin信号通路,调控SCC-9中的促融合蛋白syncytin-1的表达,然后通过syncytin-1与ASCT-2的相互作用,进而调控SCC-9与HUVEC的细胞融合过程。