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目的本实验通过皮下注射二甲基苯蒽(7,12-dimethylbenz(a)anthracene,DMBA)诱发乳腺肿瘤,制备大鼠模型,并给予大鼠海兔素干预。通过各组大鼠肿瘤的发生率、抑瘤率及脏器因子评估海兔素对大鼠乳腺肿瘤的抑制作用。检测大鼠肠黏膜上皮结构、炎性细胞因子、肠黏膜细胞因子、肠道紧密连接蛋白以及肠道菌群水平等肠道屏障功能相关指标,初步探讨海兔素对DMBA诱发的乳腺肿瘤大鼠肠道屏障损伤的保护作用。方法1.动物模型的建立:2月龄SPF级雌性SD大鼠30只,体质量200~220 g,适应性喂养1周以后,按照体质量随机分为3组,每组10只,即正常对照组、模型组和海兔素干预组。除正常对照组外,其余两组于大鼠右侧臀部皮下一次性注射100 mg/kg DMBA;正常对照组相应注射等量的吐温80。次日起,海兔素干预组给予40 mg/kg海兔素灌胃,正常对照组和模型组均给予等量大豆油灌胃。每天1次,实验持续16周。末次灌胃后,采用代谢笼收集各组大鼠粪便3~5粒,放置于无菌10 mL离心管中,-80℃冻存,用于大鼠粪便DNA的提取。禁食12 h后,3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离血浆,完整剥离肿瘤及脏器组织,用于后续实验。2.肿瘤组织病理诊断:取模型组和海兔素干预组大鼠肿瘤组织,10%甲醛固定、常规石蜡包埋、切片、脱水,进行HE染色,采用光学显微镜观察各组组织形态学变化。3.计算各组大鼠乳腺肿癌发生率及抑瘤率。4.HE染色法评价大鼠空肠组织形态。5.酶联免疫(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测大鼠血清中IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α的浓度。6.ELISA法检测各组大鼠D-乳酸(D-LA)和二胺氧化酶(DAO)的水平。7.蛋白印迹(Western Blotting)观察大鼠肠道紧密连接蛋白occludin和ZO-1表达量。8.实时荧光定量PCR技术(Real-Time PCR)对大鼠粪便肠道菌群16s RDNA V3可变区进行定量分析。结果1.正常对照组大鼠未见肿瘤。肿瘤的平均潜伏期模型组较短,海兔素组显著延长(P<0.05);抑瘤率达到49.83%,且胸腺指数明显升高(P<0.05)。2.HE染色显示,与正常对照组相比,模型组大鼠的肠壁受到损伤,肠绒毛数量减少、长度变短,大部分绒毛膨大融合,顶端出现缺损;海兔素干预后,肠绒毛形态恢复、结构清晰。3.与正常对照组大鼠相比,模型组大鼠血浆中D-LA及DAO水平明显升高(P<0.05),海兔素干预后,D-LA水平呈降低趋势(P>0.05),DAO水平显著降低(P<0.05)。4.与模型组相比,海兔素组大鼠血浆中IL-4浓度升高(P<0.05);IL-6水平明显降低(P<0.05)。5.Western blotting结果得出,模型组较正常对照组大鼠occludin和ZO-1的表达显著降低(P<0.05);海兔素干预后,occludin和ZO-1的表达均明显升高(P<0.05)。6.RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,模型组大鼠肠道大肠杆菌、粪球杆菌、柔嫩梭菌、乳酸杆菌、双歧杆菌均有显著性差异(P<0.05)。海兔素干预后,粪球杆菌、双歧杆菌虽有不同程度的升高,但差异无统计学意义(P>0.05);大肠杆菌、柔嫩梭菌及乳酸杆菌与模型组相比,差异具有显著性意义(P<0.05)。结论1.海兔素在一定程度上可抑制DMBA诱导的大鼠乳腺肿瘤的发生和发展。2.海兔素可通过修复受损的肠黏膜、改善肠黏膜的通透性、加强肠道免疫屏障以及调节肠道菌群,改善受损的肠道屏障。