论文部分内容阅读
研究目的：在西欧、北美等发达国家,乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位,我国乳腺癌的发病率也在逐年上升。越来越多的研究表明,肿瘤干细胞是肿瘤耐药,复发和转移的主要原因。慢性炎症参与了恶性肿瘤发生、发展、侵袭、转移等全部病理过程,被称为恶性肿瘤的第七大生物学特征。慢性炎症能够激活肿瘤干细胞并引起肿瘤耐药和转移。然而,慢性炎症调控肿瘤干细胞的分子机制并不是十分清楚。Lin28是RNA结合蛋白,研究发现在人类15%的肿瘤组织中Lin28都高表达。Lin28能够促进肿瘤的起始,发展和转移。Lin28通过调节let-7的表达调控乳腺癌肿瘤干细胞的功能。然而,有关Lin28在维持肿瘤干细胞功能中与其他调控干性的关键信号通路以及关键基因之间的相互作用还不十分清楚。本研究以人乳腺癌为研究对象,利用大量临床样本和体内外实验方法,分析Lin28B与肿瘤干细胞以及乳腺癌临床进程的相互关系,进一步分析Lin28B介导炎性分子IKKβ调控肿瘤干细胞的分子机制,并在动物水平上探讨以关键炎性分子IKKβ为治疗靶点抑制肿瘤干细胞与肿瘤转移的可行性,为临床治疗肿瘤提供理论基础和新的思路。研究方法：首先,我们利用免疫组织化学染色和免疫荧光染色的方法对乳腺癌组织中的Lin28B和肿瘤干细胞标志ALDH1进行检测,分析其表达与乳腺癌临床分期的相关性,明确Lin28B在乳腺癌发生发展中的作用。进一步,利用体外实验探讨Lin28B与乳腺癌干细胞的干性特征之间的关系。我们在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中建立稳定沉默Lin28B的细胞系,运用流式细胞技术检测ALDH+细胞的比例,运用体外成球实验分析肿瘤细胞的自我更新能力,运用侵袭小室实验检测肿瘤细胞的体外侵袭能力。在体内我们利用NOD/SCID小鼠移植瘤模型,采用PET扫描技术和H&E染色技术分析肿瘤细胞的肺转移,并且用游标卡尺连续监测肿瘤生长情况。其次,我们利用siRNA干扰技术和IKKβ激酶的小分子抑制剂IMD-0354作用于MDA-MB-231细胞,研究炎性分子IKKβ对肿瘤干细胞的影响。其中包括流式检测ALDH+细胞的比例、肿瘤细胞体外成球实验以及Western blot检测干性基因Lin28B、SOX2、OCT4和Nanog的表达。在体内,我们同样利用NOD/SCID小鼠移植瘤模型,采用小动物活体成像技术和H&E染色技术研究IMD-0354对MDA-MB-231肿瘤细胞肺转移的影响。为了深入研究炎性分子IKKβ调控Lin28B和肿瘤干细胞的分子机制,我们利用信号通路报告基因系统筛选IKKβ激酶调控的主要信号通路,利用siRNA干扰技术、染色质免疫共沉淀技术和报告基因检测技术研究转录因子TCF4对Lin28B的调控机制。进一步,为了研究Lin28B调控Wnt信号通路的分子机制,我们利用稳定沉默Lin28B的MDA-MB-231细胞系模型,采用TOPflash/FOPflash报告基因检测系统检测Wnt信号通路的活性,利用Western blot技术和共聚焦显微镜检测Lin28B对Wnt信号通路关键蛋白及其下游基因的影响,利用RNA免疫共沉淀技术检测Lin28B与TCF4的mRNA之间的相互作用,利用免疫组织化学技术研究乳腺癌临床样本中Lin28B和TCF4的相关性。最后,我们利用NOD/SCID小鼠移植瘤模型,研究IMD-0354联合化疗药紫杉醇对MDA-MB-231肿瘤生长和转移的影响。我们用游标卡尺连续测量小鼠肿瘤的体积,利用活体成像技术和H&E染色技术分析肿瘤的肺转移情况,利用流式技术检测ALDH+细胞的比例,利用免疫组织化学染色技术检测用药前后p-IKKβ、TCF4、 Lin28B和ALDH1的表达变化。实验结果：1.通过对102例乳腺癌组织和12例癌旁组织中Lin28B和ALDH1的表达检测发现,Lin28B的表达水平与乳腺癌临床分期呈正相关,并且与ALDH1的表达也呈正相关。2.体外沉默Lin28B能够明显减少MDA-MB-231细胞中ALDH+细胞的比例,抑制其成球能力和体外侵袭能力；体内实验表明,沉默Lin28B能够明显抑制肿瘤细胞在NOD/SCID小鼠体内的生长和肺转移。3. IKKβ激酶在MDA-MB-231肿瘤干细胞中活性增高,抑制IKKβ的表达或者抑制其活性都能够抑制Lin28B的表达,并且IKKβ抑制剂IMD-0354能够抑制MDA-MB-231细胞中ALDH+细胞的比例,抑制其成球能力和体外侵袭能力,在体内能够抑制肿瘤肺转移。4.抑制IKKβ的表达能够抑制Wnt信号通路转录因子TCF4的表达,并且TCF4能够直接与Lin28B基因的第一个内含子结合以促进其转录。5.沉默Lin28B能够抑制Wnt信号通路的活性并抑制TCF4及其下游基因的表达,Lin28B能够直接与TCF4的mRNA结合促进其翻译。通过乳腺癌组织芯片分析发现,Lin28B的表达与TCF4呈显著正相关。6. IKKβ激酶抑制剂IMD-0354联合化疗药紫杉醇能够抑制MDA-MB-231肿瘤细胞的生长和肺转移,减少其中肿瘤干细胞的比例,其作用机理是通过抑制IKKβ/TCF4/Lin28B/ALDH1通路实现的。结论：本研究通过临床样本的分析检测,观察到Lin28B在乳腺癌组织中高表达并与其临床进展呈正相关,并在体外证实Lin28B维持肿瘤干细胞功能的重要作用,揭示了IKKP激酶通过调控TCF4/Lin28B正反馈环路维持肿瘤干细胞功能的分子机制。最后证明以IKKβ激酶为治疗靶点,能够抑制Lin28B的表达和肿瘤干细胞的功能进而抑制肿瘤的生长和转移,为临床治疗乳腺癌提供了新的思路和理论基础。