研究背景和目的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病。RA可发生于任何年龄,患者以女性居多。RA患病率在自身免疫性结缔组织病中居于首位,我国RA病患病率略低于世界水平在0.24%-0.4%之间。RA患者早期常表现为关节红肿热痛和功能障碍,如不能及时诊治,发病两年内约70%-90%会出现关节破坏进而发展为关节僵直、畸形等,RA致残率极高,带来严重的社会问题和经济负担。RA发病发病涉及环境因素、遗传易感性及免疫系统紊乱等多种因素,迄今RA确切发病机制尚无定论。既往研究表明,感染因子及自身免疫反应介导的免疫损伤和修复在RA的发病中起着重要作用。抗原呈递细胞对自身抗原的异常加工、处理及呈递,导致自身反应性T细胞大量激活,继而引发其他免疫细胞的活化、免疫球蛋白的产生、致炎细胞因子及氧自由基等炎症介质增多,进而引起血管炎、滑膜增生、软骨及骨破坏等类风湿关节炎的特征性病理变化。近年来,越来越多的研究表明,免疫调节系统在RA发病中发挥着重要作用。调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)是免疫调节系统中至关重要的调节性细胞。Treg细胞可通过细胞接触机制抑制自身反应性T细胞的过度活化、分泌免疫抑制性细胞因子抑制体内炎症反应,从而在维持外周免疫功能稳态及免疫耐受中发挥重要的作用。Treg数量或功能的改变参与许多疾病的发生与发展,包括肿瘤、自身免疫性疾病等。虽然Treg在RA发病中的作用及机制尚未完全阐明,但已有许多研究证实Treg在RA发病过程中发挥着重要作用。最近研究者对小鼠Treg细胞的研究发现,基于ICOS分子的表达,可将小鼠Treg细胞进一步分为ICOS+Treg和ICOS-Treg两个细胞亚群,研究发现ICOS+Treg细胞比ICOS-Treg细胞发挥更强的免疫抑制功能,ICOS+Treg通过分泌IL-10和TGF-B抑制CD4+T细胞增殖,而后者仅通过分泌TGF-B发挥功能,且在体外培养时,ICOS-Treg容易凋亡,而ICOS+Treg具有很强的抗凋亡及增殖能力。因此,研究者认为ICOS+Treg细胞才是Treg细胞群中真正发挥免疫功能的细胞亚群,以ICOS+Treg细胞为靶点可以为自身免疫性疾病和肿瘤的治疗提供新的方案。此外,在过敏性哮喘小鼠模型ICOS+Treg可通过分泌IL-35抑制IL-17的产生,逆转IL-17依赖的过敏性气道高反应。在正常人中也发现,ICOS+Treg细胞也可分泌IL-35,同样比ICOS-Treg细胞发挥更强的免疫功能。然而,目前尚未见到关于ICOS+Treg细胞在RA中的研究报道。既往认为B细胞主要通过呈递抗原和产生抗体在免疫系统中发挥重要作用。然而,近年来研究发现B细胞与调节性T细胞一样具有负向免疫调节功能。Janeway等首次在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中发现具有负向免疫调节功能的B细胞,Bhan等在慢性结肠炎中发现B细胞能抑制T细胞介导的炎症反应,并首次提出“调节B细胞”的概念。随后,研究者在其他多种疾病的小鼠模型中都证实了发挥负向免疫调节功能的B细胞的存在。Tedder等研究者于2008年首次在小鼠脾脏中鉴定出表型为CD19+CD5+CDldhi的负向免疫调节性B细胞亚群,因其主要通过分泌IL-10发挥免疫调节作用,故将其命名为B10细胞。在小鼠多发性硬化症模型中的研究发现,B10细胞成熟后可分泌IL-10,进而抑制自身免疫性疾病,此过程还需要IL-21及其与B细胞表面CD40间相互作用,体外给予CD40和IL-21受体信号可驱动B10细胞的成熟及大量增殖,小鼠在回输体外增殖的产IL-10的B10细胞后疾病症状的到了明显的改善。因此,体外增殖后回输自体B10细胞有望为一些自身免疫疾病患者提供一种新型有效的治疗理念与治疗方法。然而目前多数B10细胞的相关研究自动物实验。B10细胞是否参与RA的发病,目前尚未见到相关研究报道。研究目的综上所述,ICOS+Treg细胞和B10细胞均为免疫调节系统中发挥负向免疫调节功能的新型且重要的细胞亚群且参与人类多种疾病的发生发展。本课题拟以ICOS+Treg细胞和B10细胞亚群为研究靶标,综合分析其在RA患者中的细胞比例及其细胞因子分泌水平,探讨其在RA发病中的作用及相关作用机制。研究方法1研究对象1.1病例组：随机选择2013年5月至2014年2月南方医科大学南方医院确诊为RA的19例患者作为病例组,其中男性1例,女性18例,平均年龄为46.16±13.74岁。所有纳入的患者均符合2009年美国风湿病学会(ACR)和欧洲抗风湿病联盟(EULAR)共同提出了新的类风湿关节炎分类标准,并除外感染、原发性心、肝、肾等器质性病变以及合并其他自身免疫病史等。采用28关节疾病活动指数(Disease activity score28,DAS28)评分系统对患者进行疾病活动度评估,根据DAS28<2.6为疾病缓解,2.6-3.2为低度活动,3.3-5.1为中度活动,DAS28>5.1为高度活动,结合我们的研究目的,将评分<3.3分定义为缓解期,≥3.3分定义为活动期。1.2疾病对照组：根据美国风湿病学会(ACR)1997年推荐的SLE的分类标准,选取同期南方医科大学南方医院确诊为SLE的29例患者作为疾病对照组,其中男性3例,女性26例,平均年龄为32.62±12.91岁。除外感染、原发性心、肝、肾等器质性病变以及合并其他自身免疫病史等。采用系统性红斑狼疮疾病活动指数评分(Systemiclupus erythematosus Disease activity index,SLEDAI)对患者进行疾病活动性评估,根据0-4分为基本无活动,5-9分为轻度活动,10-14分为中度活动,≥15分为重度活动,本次研究将评分<10分定义为缓解期,≥10分定义为活动期。1.3正常对照组：随机选取同期南方医科大学南方医院17例健康查体者作为正常对照组,平均年龄33.35±5.72岁,其中男性1例,女性16例,均排除感染、原发性的心、肝、肾等器质性病变以及自身免疫病史等。三组年龄、性别之间均无显著性差异。2研究方法2.1采用多色流式细胞术检测RA患者、SLE患者以及正常对照者外周血ICOS+Treg细胞和B10细胞比例将表面分子的荧光标记抗体和相应的同型对照分别置于流式管底部,分别100u1混匀全血,轻轻混匀,避光孵育,洗涤细胞后进行固定、破膜、胞内分子染色标记,洗涤后用多聚甲醛重悬细胞,24小时内上机分析。采用BDLSRFortessa流式细胞仪进行检测,计数至少10万个细胞,利用仪器配置BDFACSDiva软件进行相关参数获取和数据分析。2.2新鲜外周血全血联合刺激5小时后ICOS+Treg细胞分泌IL-35、IL-10、TGF-β、IL-17及B10细胞分泌IL-10、TGF-β、IL-17的检测取适量肝素钠抗凝全血,加入RPMI1640全培1：1混匀,加入佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)、离子霉素(Ionomycin)联合刺激剂,ICOS+Treg细胞因子检测加入布雷菲德菌素A(BrefeldinA,BFA)阻断剂,B10细胞因子检测加入莫能菌素(Monensin)阻断剂,在37oC、50%CO2培养箱中培养5个小时后收集细胞,离心后去上清,混匀,进行表面染色、固定、破膜和胞内染色。流式分析同前。2.3新鲜外周血单个核细胞在anti-CD3和rhIL-2刺激培养6天后ICOS+Treg细胞比例和细胞因子及在LPS刺激培养6天后B10细胞比例和细胞因子的检测采用梯度密度离心法分离外周血单个核细胞,调整细胞浓度后接种到12孔培养板中,ICOS+Treg细胞加入抗CD3抗体和重组人IL-2,B10细胞加入LPS,在37oC、5%C02的培养箱中培养6天。在收集细胞前的5个小时ICOS+Treg细胞加入PMA、离子霉素及BFA, B10细胞加入PMA、离子霉素及莫能菌素,收集细胞,离心去上清,混匀后进行表面染色、固定、破膜和胞内染色。流式分析同前。3统计方法采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析。所有计量资料均采用Mean±SD表示,采用Levene法进行方差齐性检验,多样本均数比较数据不满足方差齐性采用Welch法,进一步多重比较采用Dunnett T3法进行两两比较；数据满足方差齐性多样本均数比较采用Fish法,进一步多重比较采用LSD法进行两两比较。两独立样本均数比较采用独立样本T检验。方差齐性检验及样本均数比较均取a=0.05为检验标准。结果1RA患者外周血中ICOS+Treg细胞、B10细胞数及其与疾病活动性的分析1.1RA、SLE、NC三组ICOS+Treg细胞数及ICOS+Treg/ICOS-Treg比值总体比较均有显著性差异(P=0.001；P=0.001),其中RA组均显著高于正常对照组(12.589±7.156VS.4.359±4.569, P=0.001;0.401±0.337VS.0.085±0.097, P=0.001), RA组与SLE组间均无显著差异(P>0.05)。疾病活动性分析显示,RA活动组和缓解组ICOS+Treg细胞数均显著高于正常对照组(P=0.001；P=0.003),RA缓解组ICOS+Treg/ICOS-Treg比值显著高于正常对照组(P=0.000),活动组于正常对照组间无显著差异(P>0.05)。1.2RA、SLE、NC三组B10细胞数总体比较有显著性差异(P=0.002),其中RA组显著高于正常对照组(1.335±0.869VS.0.565±0.398,P=0.009),RA组与SLE组间无显著差异(P>0.05)。疾病活动性分析显示,RA活动组和缓解组B10细胞数均显著高于正常对照组(P=0.009；P=0.011),活动组与缓解组间无显著差异(P>0.05)。2刺激培养5小时后ICOS+Treg细胞及B10细胞分泌细胞因子及其与疾病活动性的分析2.1ICOS+Treg细胞分泌细胞因子RA、SLE、NC三组分泌IL-10总体比较无显著差异(3.961±4.181VS.3.079±4.280VS.2.176±2.824,P>0.05)；RA组分泌IL-17显著高于正常对照组(8.479±8.529VS.2.424±2.811,P=0.008),RA组与SLE组间无显著差异(P>0.05)；RA组分泌TGF-β与正常对照组无显著差异(P>0.05),但显著低于SLE组(8.879±9.420VS.19.162±24.379,P=0.047)。疾病活动性分析显示,RA活动组、缓解组及正常对照组间分泌IL-10均无显著差异(P>0.05)；RA活动组分泌IL-17显著高于缓解组与正常对照组(P=0.032；P=0.007),缓解组与正常对照组间无显著差异(P>0.05)；RA活动组分泌TGF-β显著高于缓解组(P=0.021),缓解组与正常对照间均无显著差异(P>0.05)。2.2B10细胞分泌细胞因子RA组分泌IL-10、IL-17及TGF-β均显著高于正常对照组(13.918±14.106VS.1.841±2.102,P=0.008:12.482±12.438VS.5.500±5.739, P=0.047；16.565±10.526VS.3.288±2.753,P=0.000),RA组与SLE组间均无显著差异(P>0.05)。疾病活动性分析显示,RA活动组和缓解组分泌IL-10和TGF-β均显著高于正常对照组(P=0.019,P=0.031；P=0.002,P=0.024),活动组与缓解组间无显著差异(P>0.05)。RA活动组、缓解组及正常对照组间分泌IL-17均无显著差异(P>0.05)。3anti-CD3和rhIL-2刺激培养6天后ICOS+Treg细胞数及其分泌细胞因子及其与疾病活动性的分析3.1RA组ICOS+Treg细胞数高于正常对照组但差异无统计学意义(13.671±20.467VS.3.782±2.708,P>0.05),RA组显著低于SLE组(13.671±20.467VS.27.132±15.491,P=0.039)；RA组ICOS+Treg/ICOS-Treg比值显著高于正常对照组(1.039±0.588VS.0.296±0.334,P=0.000),RA组与SLE组间无显著差异(P>0.05)。疾病活动性分析显示,RA活动组、缓解组及正常对照组间ICOS+Treg细胞数均无显著差异(P>0.05)；RA活动组、缓解组ICOS+Treg/ICOS-Treg比值均显著高于正常对照组(P=0.011；P=0.004)。刺激培养6天后RA组ICOS+Treg细胞数较培养前无显著差异(P>0.05)；RA组ICOS-Treg细胞数较培养前显著减少(10.536±9.718VS.39.095±18.313,P=0.000),其中RA活动组显著减少(P=0.000),缓解组差异不显著(P>0.05)；RA、SLE、NC三组ICOS+Treg/ICOS-Treg比值较培养前均显著增高(1.039±0.588VS.0.401±0.337,P=0.002；0.785±0.496VS.0.323±0.266,P=0.001；0.296±0.334VS.0.085±0.097,P=0.022)。3.2ICOS+Treg细胞分泌细胞因子RA组分泌IL-10和TGF-β均显著高于SLE组与正常对照组(5.931±4.952VS.1.795±2.871,P=0.042；5.931±4.952VS.0.735±1.392,P=0.008；15.369±8.478VS.6.942±5.574,P=0.000;15.369±8.478VS.9.929±4.784,P=0.022)；RA组分泌IL-17和IL-35均显著高于正常对照组(4.654±3.499VS.1.259±1.246,P=0.014；2.277±1.522VS.0.265±0.442,P=0.001),RA组与SLE组间无显著差异(P>0.05)。疾病活动性分析显示,RA缓解组分泌IL-35显著高于活动组(3.800±0.920VS.1.600±1.301,P=0.013)；RA缓解组分泌IL-10和TGF-β均高于活动组,而IL-17则活动组高于缓解组,但差异均无显著差异(P>0.05)。刺激培养6天后RA组分泌IL-35较刺激5小时显著增高(5小时未检测到)；RA组分泌IL-10和TGF-β均较刺激5小时检测时增高,分泌IL-17较5小时降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。4LPS刺激培养6天后B10细胞数及其分泌细胞因子及其与疾病活动性的分析4.1RA, SLE、NC三组B10细胞数总体比较有显著性差异(P=0.017),其中,RA组显著高于正常对照组(6.490±5.393VS.1.700±1.515,P=0.021),RA组与SLE组间无显著差异(P>0.05)。疾病活动性分析显示,RA缓解组B10细胞数显著高于正常对照组(4.850±1.622VS.1.700±1.515,P=0.002),活动组增高但差异不显著(7.583±6.870VS.1.700±1.515,P=0.090),活动组与缓解组间无显著差异(P>0.05)。刺激培养6天后RA、SLE、NC三组B10细胞数较培养前均显著增高(P=0.014；P=0.042；P=0.008),其中RA缓解组显著增高(4.850±1.622VS.1.100±0.415,P=0.017),活动组增高,但差异不显著(7.785±6.870VS.1.600±0.981,P=0.086)。4.2B10细胞分泌细胞因子RA组分泌IL-10显著高于正常对照组(7.300±8.655VS.0.847±1.402,P=0.043),RA组与SLE组间无显著差异(P>0.05),其中RA活动组与缓解组分泌IL-10均显著高于正常对照组(P=0.001；P=0.024),活动组与缓解组间无显著差异(P>0.05)。RA、SLE、NC三组分泌IL-17总体比较无显著差异(P>0.05)。RA组分泌TGF-β显著高于SLE组与正常对照组(38.050±25.05IVS.15.806±18.372,P=0.007；38.050±25.051VS.19.922±12.946,P=0.05),其中RA活动组分泌TGF-β显著高于正常对照组(41.933±29.962VS.15.806±18.372,P=0.019),缓解组与正常对照组间无显著差异(P>0.05)。刺激培养6天后RA组分泌TGF-β较刺激5小时显著增高(30.050±25.051VS.16.565±10.675,P=0.026),其中活动组和缓解组均增高但差异无统计学意义(P>0.05)。结论1RA患者外周血ICOS+Treg细胞和B10细胞数显著高于正常对照组,且RA活动组与缓解组均显著增高,ICOS+Treg细胞和B10细胞可能参与RA的发病。2RA活动组ICOS+Treg细胞分泌IL-17显著增高,分泌IL-35、IL-10、TGFβ均无显著差异；体外刺激培养6天后,活动组ICOS+Treg细胞分泌IL-17高于缓解组,分泌IL-35、IL-10、TGFβ均低于缓解组。ICOS+Treg细胞通过分泌促炎因子IL-17在RA的发病中起致病作用。3RA缓解组ICOS+Treg细胞分泌IL-35、IL-10、TGFβ及IL-17均无与正常对照组无显著差异,但体外刺激培养6天后,缓解组ICOS+Treg细胞分泌IL-35、IL-10、TGFβ均高于活动组,分泌IL-17低于活动组。在RA疾病缓解期,ICOS+Treg细胞主要通过分泌免疫抑制性细胞因子IL-35、IL-10及TGFβ发挥免疫调节功能,从而达到对机体的保护作用。4RA活动组和缓解组BI0细胞分泌IL-10和TGFβ均显著高于正常组,分泌工L-17均无显著差异；体外刺激培养6后,B10细胞分泌IL-10和TGFβ仍显著增高,分泌工L-17仍无显著差异。B1O细胞在RA的发病中不起主要作用,主要通过分泌免疫抑制性细胞因子IL-10和TGFβ对机体起保护作用。