枸杞(Lycium barbarum)是茄科枸杞属植物，在我国栽培比较广泛。枸杞中富含多种营养成分，如枸杞色素、枸杞多糖、甜菜碱、氨基酸等。黑色枸杞果实中的天然色素大多以花青素类色素为主，红色枸杞果实中类胡萝卜素含量较高。花青素是一种存在于植物中的显色水溶性类黄酮化合物，有抗氧化、抗辐射、降血糖等药理作用，具有较高的营养价值。目前，黄枸杞的研究主要在组培、栽培等方面，在遗传方向上的研究较少。黄枸杞果实中花青素生物合成代谢通路是否被激活，黄枸杞中花青素生物合成代谢的分子机制尚不明确。本研究利用转录组测序技术比较黑枸杞和黄枸杞果实中所有转录本表达差异，分离黄枸杞果实中调控花青素生物合成候选基因AN2y，并对其进行分子功能验证相关的研究。主要研究结果如下。
　　1、转录组测序结果：黑枸杞原始读数为53.85Mb，黄枸杞原始读数为43.63Mb，两个样本共有原始读数为97.48Mb，拼接组装共得到131,603个unigenes，共有261,574个蛋白获得注释信息。在黑枸杞和黄枸杞中共有34,536个unigenes差异表达，以黑枸杞为对照，黄枸杞中表达量上调的基因有25,961个，下调的基因有8575个。GO数据库中，有137,182个与分子功能有关的基因，有233,689个与细胞组分有关的基因，有170,807个与生物学过程有关的基因。KEGG富集分析中，参与次生生物合成代谢有关的差异表达基因有721个。在参与花青素合成代谢的相关基因中发现，CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS、ANR有同源基因，在黄枸杞果实中CHI表达量提高20.09倍、DFR表达量提高29.78倍、ANS表达量提高2.46倍。前人对红枸杞和黑枸杞果实中所有转录本表达差异进行研究，筛选出了控制黑枸杞果实中花青素合成代谢候选基因LrAN2，用同样的比对方式，在黑枸杞和黄枸杞果实中一共发现同样的有7个转录本，经测序得出这7个转录本序列一致。MYB转录因子CL2214.Contig1_All、CL2214.Contig3_All、CL2214.Contig7_All在黄枸杞中的表达量都下调，而MYB转录因子CL2214.Contig1_All下调幅度最低，故筛选MYB转录因子CL2214.Contig1_All(AN2y)作为调控黄枸杞果实中花青素合成代谢的候选基因。
　　2、生物信息学分析结果：AN2y基因CDS序列全长774bp，开放阅读框编码257个氨基酸，分子量为29688.36Da，等电点为8.19，不稳定指数为53.08，脂肪指数为73.62。在该蛋白的257个氨基酸组成中，有35个正电荷氨基酸残基数，有33个负电荷氨基酸残基数。对AN2y蛋白质保守结构域进行预测，预测结果显示此蛋白在N端存有PLN03212超家族。使用ProtScale软件进行亲疏水性的解析，结果显示它的平均值为-0.804，说明AN2y蛋白质具有亲水性。根据SOPMA在线软件得到AN2y编码蛋白的二级结构，主要部分是α-螺旋(34.63%)和不规则盘绕(52.53%)，其次是延伸链(6.61%)和β-转角(6.23%)。使用TMHMM软件分析显示AN2y蛋白质不通过跨膜区，在膜外进行作用。系统进化树分析发现AN2y基因与矮牵牛、金鱼草、葡萄、拟南芥等物种MYB调节基因的亲缘关系相近，同时通过氨基酸序列比对，发现黄枸杞AN2y与黑枸杞LrAN2氨基酸序列相似度最高，达到98.44%，仅存在4个氨基酸差异；黄枸杞AN2y与矮牵牛phAN2氨基酸序列相似度到达57.31%，综上说明AN2y有可能是一种具有功能性的MYB转录因子。
　　3、转基因功能验证结果：Gateway技术构建过量表达载体PJAM1502:AN2y，并通过农杆菌侵染将AN2y基因转染到模式植物烟草中，得到紫色烟草表型。转基因型烟草的分子鉴定结果得到了特异性条带；花青素含量测定结果得出转基因型烟草的种子中花青素含量最高；qPCR显示转基因型烟草中花青素生物合成代谢中相关酶的结构基因的表达量都显著上调，其中ANS的表达量最为明显；转基因型烟草的根、茎、叶、花以及种子中AN2y基因表达量都明显上调，其中转基因型烟草的种子中AN2y基因表达量最高。通过转基因功能验证，证明了候选基因AN2y具有调控黄枸杞中花青素生物合成代谢的功能。