一、研究背景和目的：　　 尿路感染(Urinary tract infection,UTIs)是临床上最普遍的细菌感染之一。女性比男性易感,约有81％的UTIs发生在女性,年龄在16到35岁之间,其中27％女性在初次尿路感染后半年内复发,48％在一年内复发。其次,UTIs也是老年人和小儿常见的感染性疾病[1-3]。目前尿路感染以抗生素治疗为主。　　 尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)引起的UTIs占80％-90％。大部分尿路致病菌起源于肠道,并经尿道上行至膀胱,约95％的UTIs起始感染部位是膀胱。目前对尿路感染的研究主要围绕UPEC展开的。UPEC相关毒力因素包括:α-溶血素、细胞毒坏死因子1等毒素；含铁产气杆菌素；荚膜；脂多糖等和一些粘附器官[4-9]。其中UPEC对宿主尿路上皮细胞的粘附能力是其致病的最重要因素,粘附素的表达常常是致病的关键,其有助于UPEC黏附尿路从而避免被大量尿液冲刷清除。流行病学分析及临床研究表明:不同于直肠来源的大肠杆菌,UPEC几乎都是B2型,表达典型的UTIs相关O抗原,带有许多与尿路致病相关的毒力基因,如:编码FimH黏附素的基因fimH,编码P菌毛的基因pap,编码S菌毛的基因sfaS,编码溶血素的基因hly,编码鼠疫菌素受体的基因fyuA以及编码大肠杆菌外膜蛋白T的基因ompT等。这些毒力基因的功能多与粘附、侵袭、血清抗性和代谢等相关,并得到实验证实[11]。但有些基因,如ompT,绝大多数UPEC都携带此基因,是假定的UTIs相关毒力基因,而关于ompT在尿路致病机制中的功能一直未得到实验证实。本课题的目的在于初步研究基因ompT在UPEC的致病机理中是否起到一定作用。　　 本研究利用Red同源重组系统构建UPCE CFT073的ompT基因敲除株,命名为COTD,建立人膀胱上皮细胞株5637体外细胞模型,考察ompT基因的缺失对致病株黏附及侵袭能力的影响。并且通过红细胞凝集试验观察ompT基因对Ⅰ型菌毛的表达是否有影响。同时建立UPEC易感小鼠C57BL/6的UTIs模型,考察ompT基因的缺失是否对细菌体内侵袭能力产生影响；通过病理切片分析,观察细菌体内聚集形态的变化。为进一步研究ompT基因敲除导致的致病差异是否通过OmpT酶活性起作用,需克隆表达OmpT及失去蛋白酶活性的OmpT。因此本文第三章内容为构建蛋白OmpT及其失去酶活的点突变体的表达纯化及复性方法,并对两者酶活进行鉴定,观察OmpT体外水解抗菌肽的能力以及对UPCE的保护作用。　　 二、研究方法：　　 1、Red同源重组　　 本方法是利用大肠杆菌λ噬菌体的Red重组系统可在细菌内高效介导同源重组事件的原理,将两端带有同源重组臂的一段外源DNA序列导入并替换细菌基因组上同源重组臂序列间的DNA序列,达到目标基因敲除的目的。　　 第一步构建敲除子。根据NCBI网站上获得的ompT基因序列,选取该基因开放阅读框上下游50 bp片段作为同源重组臂。然后根据卡那抗性基因序列设计一对扩增引物,分别与同源重组臂组成敲除子引物,命名为OmpT_Kan_F2和OmpT Kan R2,以pET28a载体为模板,利用PCR技术扩增并纯化敲除子。第二步,将编码Red重组系统gam、bet和exo基因的重组质粒pKD46电转化到CFT073,以氨苄抗性平板筛选阳性克隆,把敲除子电转化到转化了pKD46的CFT073中,通过L-阿拉伯糖诱导同源重组的发生,以卡那霉素平板筛选出发生同源重组的克隆。最后通过正向和反向筛选鉴定敲除体:正向筛选,在5’和3’同源重组臂的外侧设计PCR引物。比较用这对引物从卡那霉素抗性克隆和CFT073扩增出的PCR片段的大小。从未发生正确重组的细菌克隆上,这对引物扩增产物的长度为1781 bp；而从发生正确敲除的细菌克隆(敲除体)上,这对引物扩增产物的长度为2066 bp,反向筛选,在ompT基因开放阅读框序列内部设计一对引物。从CFT073和未发生正确重组的细菌克隆上,这对引物可扩增出预期长度的PCR片段；而从已正确敲除ompT基因的敲除体上,这对引物不能扩增出相应的产物。将成功构建的敲除体命名为COTD。　　 2、CFT073与COTD生长曲线的绘制以及菌落培养　　 (1)生长曲线:从新鲜涂布的平板中挑取单菌落接种到5 mL新鲜LB培养基中静置培养过夜,次日再将菌液以1:100的比例接种到LB培养基,37℃,160r/min摇床培养,间隔一定时间取样测OD600,绘制生长曲线图。　　 (2)菌落培养:将冻存菌液以1:100的比例接种到新鲜LB培养基中,37℃静置培养14 h,取菌液做系列10倍稀释,取10-6和10-7稀释菌液50μl涂布LB平板,静置培养过夜后计菌落数。　　 3、体外细菌黏附及侵袭实验　　 体外细胞模型采用人膀胱癌上皮细胞5637,将该细胞接种到24孔细胞培养板,待细胞铺满单层(约1×105细胞/孔),以100细菌:1细胞的比例将细菌接种到已准备好的5637单层细胞,37℃,5％CO2孵育2 h。接入的细菌样品梯度稀释涂板计数作为接种的总细菌数。黏附实验中,孵育2 h后,用PBS清洗5遍,去掉PBS加入0.5％Triton X-100裂解细胞,吸出每孔样品梯度稀释涂板计数,作为黏附到细胞的细菌数。侵袭实验中,细胞和细菌孵育2 h后,每孔加入终浓度为200 mg/L的庆大霉素孵育杀死细胞外细菌,PBS清洗3遍,与黏附同样方法裂解细胞,吸出每孔样品梯度稀释涂板计数,作为侵袭到细胞内的细菌数。黏附实验和侵袭实验中每种菌株设三个复孔,实验至少重复3次。　　 黏附率=黏附到细胞的细菌数/接种总菌数×100％　　 侵袭率=侵袭到细胞内的细菌数/接种总菌数×100％。　　 4、红细胞凝集和抑制试验　　 由于Ⅰ型菌毛表达甘露糖敏感血凝,因此利用红细胞凝集和抑制试验观察CFT073,COTD以及COTD(pST)Ⅰ型菌毛表达情况。豚鼠心脏取血制备红细胞,在96孔V型反应板中先加入25μL PBS,然后在每组第一孔加入菌株,依次稀释,混匀,最后加入制备好的红细胞25μL,混匀,37℃孵育1h后观察结果。红细胞凝集抑制试验中,在各菌株依次稀释后,加入D-甘露糖,最后加入红细胞,观察红细胞凝集现象是否被D-甘露糖抑制。　　 5、小鼠尿路感染模型　　 选择7周龄SPF级C57B/L6小鼠进行尿路插管膀胱灌注细菌建立小鼠尿路感染模型,注菌量约为10×107CFU。为了观察CFT073、COTD以及COTD(pST)在动物体内侵袭能力是否有差异,在感染后6 h取膀胱组织,PBS清洗后加庆大霉素(终浓度为200μg/mL)37℃孵育1h,再以PBS清洗后,匀浆、倍比稀释,最后涂LB平板37℃培养过夜,计菌落数。为了观察CFT073、COTD以及COTD(pST)导致的细胞内细菌聚集(Intracellular bacterial community,IBC)形成情况,感染6 h后取膀胱做石蜡切片,HE染色,观察IBCs形态。　　 6、OmpT及其点突变体的原核表达　　 以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增ompT基因,连接至pET28a构建表达质粒pET-ompT。以该质粒为基础,引入点突变Asp85Ala。将重组质粒转化到BL21(DE3),经1 mmol/L IPTG诱导后OmpT及其突变体以包涵体形式大量表达。纯化后的蛋白经梯度透析复性,并加入粗制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)恢复蛋白酶活性。　　 7、OmpT及其点突变体的酶活鉴定　　 (1)RMCK分别与OmpT及其点突变体37℃孵育,取样进行SDS-PAGE电泳,观察RMCK是否被OmpT水解成多个小片段。　　 (2)取抗菌肽鱼精蛋白分别与OmpT及其点突变体共同孵育,再分别加入COTD中,同时设立COTD,COTD与鱼精蛋白孵育两组作为对照,利用光学显微镜观察四组COTD形态的差异,描绘四组COTD的生长曲线图,观察不同处理下COTD生长之间的差异。　　 三、结果：　　 1、Red重组ompT基因敲除体的构建以及生长能力测定　　 利用Red同源重组系统,构建ompT基因敲除株。在敲除子的PCR扩增和纯化中,得到大小为1602 bp的片段,与预测的片段大小一致。经测序证明敲除子的基因序列符合预期。卡那霉素抗性平板挑选出14个克隆编号并进行正向和反向筛选。正向筛选中第1,2,3,4,12,14号克隆的PCR片段为2066 bp,与预期的正确敲除体克隆大小一致。反向筛选中,第1,2,3,4,12,14号克隆的PCR片段无567 bp长度的PCR片段扩增,与预期一致。最后选取第2、3号克隆的正向筛选PCR产物,用两侧扩增引物进行测序。测序结果:第2、3号克隆基因组上ompT基因ORF区域按设计完全敲除；CFT073本身的基因组序列在测序范围内未发生任何突变；插入序列有若干点突变,是敲除子(打靶序列)构建过程中由PCR反应随机带入。敲除株COTD构建成功。　　 根据生长曲线图和菌落形成的测定,CFT073和COTD的生长曲线基本一致,且菌落形成能力无统计学差异。　　 2、ompT基因的敲除降低切UPEC体外黏附和侵袭能力　　 根据COTD及其野生株CFT073和回补株COTD(pST)体外黏附和侵袭人膀胱癌上皮细胞5637,用菌落数计算细菌的黏附率和侵袭率,多个独立样本的非参数检验分析结果显示,黏附率:x2=39.133,v=2,P<0.001；侵袭率:x2=34.527,v=2,P<0.001。可认为三种菌株间的黏附率和侵袭率间差异有显著性意义。野生株黏附率的平均秩次为38.00,突变株为8.00,回补株为23.00。野生株侵袭率的平均秩次为35.93,突变株为8.00,回补株为25.07。野生株的黏附率和侵袭率都比突变株高。且回补株的黏附率和侵袭率都有恢复。　　 野生株CFT073、敲除株COTD以及回补株COTD(pST)的红细胞凝集抗原效价平均秩次均为14.00；红细胞凝集反应均被D-甘露糖抑制。多个独立样本的非参数检验表明差异无统计学意义,表明ompT基因对Ⅰ型菌毛的表达没有明显影响。　　 3、ompT基因敲除降低UPEC体内侵袭能力并抑制IBC的膨出　　 将野生株与敲除株体内侵袭的细菌数用SPSS13.0进行多个独立样本非参数检验。分析结果显示,x2=18.063,v=2,P<0.001,组间差异有显著性意义。野生株体内侵袭细菌数的平均秩次为19.89,突变株为5.00,回补株为17.11。表明ompT基因敲除后细菌侵袭进入膀胱细胞内的数量显著减少,回补了基因ompT以后体内侵袭能力提高。病理切片HE染色显示野生株与回补株的IBCs多见数个相连,突变株的IBCs多单个存在,膨出程度也受到抑制。　　 4、成功表达OmpT及其点突变体及其酶活测定　　 成功表达纯化OmpT及其点突变蛋白,并对酶活进行鉴定。RMCK与OmpT孵育后被水解成数个小片段。未与OmpT孵育的鱼精蛋白,迅速杀死COTD,肉眼见COTD漂浮死亡,镜下观察细菌成片聚集,COTD生长在6 h内被抑制。而加入OmpT孵育后,鱼精蛋白未对COTD造成影响。与OmpT点突变体孵育的鱼精蛋白同样杀死COTD并抑制其生长。　　 四、统计学分析　　 菌落形成能力测定用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)方法分析,细菌黏附侵袭实验,HA试验以及体内动物实验数据均方差不齐,故均采用多个独立样本的非参数检验(K Independent Samples Test)。　　 五、结论：　　 1、ompT基因对UPEC体内外黏附侵袭能力以及IBCs的膨出程度均有一定影响,但可能不是通过影响Ⅰ型菌毛表达起作用。　　 2、体外表达纯化的蛋白OmpT有很强的水解抗菌肽鱼精蛋白的能力,对UPEC有保护作用,利于细菌的感染。