论文部分内容阅读
小儿肺炎为儿童呼吸系统常见病,为婴幼儿致死的常见原因,是中国重点防控的儿童常见病。中药治疗肺炎具有抗炎退热、促进细胞损伤修复、降低气道高反应性等作用,在缩短疾病疗程、改善临床症状等方面较单纯西医治疗具有显著优势。目前,中医治疗小儿肺炎肺热证阶段以宣肺化痰为主,治则上注重清热解毒,病位上主要在肺。温邪上受,首先犯肺,顺传阳明,根据小儿稚阴稚阳特点,提出在小儿肺炎肺热证阶段应肺与胃肠同治。由于小儿胃肠薄弱、易于积热,加之高热量食物的摄入,极易形成胃肠积热,而胃肠积热是影响小儿肺炎发生发展的重要因素。根据中医“既病防变”的治未病思想,在小儿肺炎肺热证阶段,调畅胃肠气机、清泄胃肠积热有利于清除肺经热邪。银莱汤在上清宣太阴肺,在下清泄阳明胃肠,肺与胃肠同治,清宣与通降并用,共奏肺与胃肠同治之效。既往实验研究发现,银莱汤具有明确的抗炎退热作用,网络药理学结果揭示银莱汤存在与炎症密切的靶点及信号通路TLRs信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路。银莱汤的抗炎退热作用机制可能通过TLR4/TNF/NF-K B信号通路,影响促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放,发挥治疗作用。本研究基于TNF-α/NF-κB信号通路和TLR4/NF-κB信号通路探讨银莱汤治疗小儿肺炎的作用机制,对于阐明中医药治疗肺炎现代生物学机制具有重要意义。实验一:基于TNF-α/NF-κB信号通路探讨银莱汤抗炎作用机制的研究目的:探讨银莱汤通过TNF-α/NF-κB信号通路治疗肺炎的作用机制。方法:将40只SPF级4周龄雄性幼鼠随机分为4组,分别为正常组、肺炎组、银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组,每组10只。使用LPS（0.5 mg/mL）连续雾化吸入3天制备肺炎模型;银莱汤治疗组连续3天早晚给予银莱汤灌胃治疗;醋酸泼尼松组连续3天早晚给予醋酸泼尼松灌胃治疗。第4天麻醉后取血及相关脏器组织;HE染色观察肺组织、肠组织形态学变化;ELISA法检测各组幼鼠肺、肠组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的变化;Western blotting检测肺组织和肠组织中TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65 蛋白的表达。结果:1.一般情况及体质量（1）一般情况:正常组幼鼠精神状态良好,活动自如,皮毛光泽度好,大便色棕黑、成形;肺炎组幼鼠精神状态差,呼吸急促,喜扎堆,竖毛,个别出现雾化后战栗,大便干结量少;银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组,经醋酸泼尼松和银莱汤治疗后的幼鼠精神状态明显好转,呼吸较前平缓,皮毛渐趋柔顺,大便干结情况偏少,扎堆活动少见。（2）体质量:第1天,与正常组比较,肺炎组、银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠体质量无明显趋势,无统计学差异（P＞0.05）。第2天,与正常组相比,银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠体质量有不同程度的减轻（P＜0.01）;与肺炎组相比,银莱汤治疗组与醋酸泼尼松组幼鼠体质量均有下降趋势,但无统计学差异（P＞0.05）。第3天,与正常组相比,肺炎组、银莱汤治疗组与醋酸泼尼松组幼鼠体质量有不同程度的降低（P＜0.01）。2.脏器指数与正常组相比,肺炎组、银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠的肺脏器指数均有不同程度的升高,且有统计学意义（P＜0.01）;与肺炎组相比,银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠的肺脏器指数差异均无统计学意义（P＞0.05）。与正常组相比,肺炎组、银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠的胸腺脏器指数均明显下降,有统计学意义（P＜0.01）;与肺炎组相比,银莱汤治疗组幼鼠胸腺脏器指数差异无统计学意义（P＞0.05）,醋酸泼尼松组幼鼠的胸腺脏器指数有统计学意义（P＜0.01）。与正常组相比,肺炎组、银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组的各组幼鼠的肝脏脏器指数、脾脏器指数、肾脏器指数均无差异（P＞0.05）。3.肺和肠组织病理（1）肺组织病理:正常组幼鼠肺泡形态规则,结构清晰完整,基本正常,未见出血及炎性细胞浸润。与正常组比较,肺炎组幼鼠肺部发生组织病变,细胞膜破坏,肺泡结构杂乱,肺泡壁增厚,肺泡腔内可见大量炎性细胞及红细胞。银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组幼鼠肺组织均出现不同程度地病变改善。（2）肠组织病理:正常组幼鼠结肠组织结构完整,隐窝较深,杯状细胞排列整齐,未见炎性细胞浸润,无溃疡。肺炎组幼鼠结肠组织大部分呈现黏膜完整性破坏,结肠隐窝和杯状细胞明显减少,炎性细胞浸润增多。银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组幼鼠结肠组织均有明显改善,隐窝变浅,杯状细胞增多,炎性细胞浸润减少。4.肺和肠组织炎症因子表达水平（1）肺组织TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平:与正常组比较,肺炎组、银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显升高（P＜0.01）。与肺炎组比较,银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠肺组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显降低（P＜0.01）。（2）肠组织TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平:与正常组比较,肺炎组、银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显升高（P＜0.01）。与肺炎组比较,银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠肠组织中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显降低（P＜0.01）。5.肺和肠组织蛋白表达水平（1）肺组织中 TNF-α/NF-κB 信号通路上 TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65蛋白表达与正常组比较,肺炎组幼鼠肺组织TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65蛋白表达明显升高（P＜0.01）;银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠肺组织TNFR1、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65 蛋白表达明显升高（P＜0.05、P＜0.01）,银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠肺组织TRADD蛋白表达升高,但无统计学意义（P＞0.05）。与肺炎组比较,银莱汤治疗组、醋酸泼尼松组幼鼠肺组织中TNFR1、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65 蛋白表达明显降低（P＜0.05、P＜0.01）,TRADD 蛋白表达降低,无统计学差异（P＞0.05）。（2）肠组织中 TNF-α/NF-κB 信号通路上 TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65蛋白表达与正常组相比,肺炎组幼鼠结肠组织TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-K B p65蛋白表达明显升高（P＜0.01）;银莱汤治疗组幼鼠结肠组织TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65 蛋白表达明显升高（P＜0.05、P＜0.01）;醋酸泼尼松组幼鼠结肠组织TNFR1、IKKβ、NF-κBp65蛋白表达明显升高（P＜0.05、P＜0.01）,TRADD、TRAF2、RIP1蛋白表达与正常组无统计学差异（P＞0.05）。与肺炎组比较,银莱汤治疗组幼鼠结肠组织中TNFR1、IKKβ、NF-κB p65蛋白表达明显降低（P＜0.05、P＜0.01）,TRADD、TRAF2、RIP1蛋白表达降低,无统计学差异（P＞0.05）;醋酸泼尼松组幼鼠结肠组织TNFR1、TRADD、TRAF2、IKKβ、NF-κB p65蛋白表达明显降低（P＜0.05、P＜0.01）,RIP1蛋白表达降低,无统计学差异（P＞0.05）。结论:银莱汤可以调控TNF-α/NF-κB信号通路中的TNFR1、TRADD、TRAF2、RIP1、IKKβ、NF-κB p65蛋白表达水平,降低肺、结肠中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平,银莱汤通过TNF-α/NF-κB信号通路改善肺、肠组织的病理损伤,达到肺、肠同治的作用。实验二:基于TLRs/NF-κB信号通路探讨银莱汤抗炎作用机制的研究目的:探讨银莱汤通过TLR4/NF-κB信号通路治疗小儿肺炎的作用机制。方法:将40只SPF级4周龄雄性幼鼠随机分为4组,分别为正常组、肺炎组、银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组,每组10只。使用LPS（0.5 mg/mL）连续雾化吸入3天制备肺炎模型;银莱汤治疗组连续3天早晚给予银莱汤灌胃治疗;醋酸泼尼松组连续3天早晚给予醋酸泼尼松灌胃治疗。第4天麻醉后取血及相关脏器组织。采用ELISA试剂盒检测各组幼鼠肺组织和肠组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平的变化;HE染色观察肺组织、肠组织形态学变化;Western blotting法检测肺组织、肠组织中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα 蛋白的表达。结果:1.血清中炎症因子表达水平与正常组比较,肺炎组幼鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显升高（P＜0.01）。与肺炎组比较,银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组幼鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β相对表达明显降低（P＜0.01）。2.肺和肠组织中 TLR4/NF-κB 信号通路上 TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白表达（1）肺组织中 TLR4/NF-κB 信号通路上 TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白表达与正常组比较,肺炎组幼鼠肺组织TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα相对表达明显升高（P＜0.05、P＜0.01）,IKBα相对表达明显降低（P＜0.05、P＜0.01）。与肺炎组比较,银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组幼鼠肺组织中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα蛋白表达明显降低（P＜0.05、P＜0.01）,IKBα相对表达明显升高（P＜0.05、P＜0.01）。（2）肠组织中 TLR4/NF-κB 信号通路上 TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα、IKBα蛋白表达与正常组比较,肺炎组幼鼠结肠组织TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65、p-IKBα相对表达明显升高（P＜0.05、P＜0.01）,IKBα相对表达明显降低（P＜0.05、P＜0.01）。与肺炎组比较,银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组幼鼠结肠组织中TLR4、NF-κB p65、p-IKBα蛋白表达明显降低（P＜0.01）;银莱汤治疗组幼鼠结肠组织中MyD88、TRAF6蛋白表达呈现下降趋势,但无统计学意义（P＞0.05）,醋酸泼尼松组MyD88、TRAF6、IKBα蛋白表达降低（P＜0.05）;银莱汤治疗组和醋酸泼尼松组幼鼠结肠组织中p-IKBα蛋白表达呈现下降趋势,但无统计学意义（P＞0.05）。结论:银莱汤可以通过调控TLR4/NF-κB炎症信号通路中的TLR4、MyD88、TRAF6、IKBα、p-IKBα、NF-κB p65蛋白表达水平,降低血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平,银莱汤通过TLR4/NF-κB通路改善肺部炎症反应,发挥抗炎作用。