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提高粮食产量以及品质,一直是科学研究的首要目标。水稻作为重要的粮食作物,产量由有效穗数、每穗实粒数和粒重这三个要素决定。其中遗传率最高的是粒重,受粒形以及灌浆程度影响。因此粒形,包括粒长、粒宽和粒厚,是重要的产量性状。根据国家标准,籼稻优质大米的国家标准是长宽比大于2.8,粒形同样也是重要的品质性状。阐明粒形的遗传基础以及分子机理有利于改良水稻的产量和品质,为育种提供更多的思路以及基因资源。GS3基因位于第三染色体着丝粒附近,是负调控粒长的主效基因,在很多群体定位中被检测到。利用GS3开发的多态性标记被广泛应用于水稻分子育种。GS3编码非典型G蛋白γ亚基,含有N端的器官大小调控结构域（OSR）以及C端的富含半胱氨酸结构域（cys-rich）。在自然群体中存在4种主要基因型:短粒品种含有GS3-1以及GS3-2等位基因,编码完整的GS3蛋白,为野生型;长粒品种含有GS3-3等位基因,编码蛋白缺失了OSR和cys-rich,其基因功能丧失;超短粒品种川7含有GS3-4等位基因,编码蛋白只有OSR,相对于GS3-1具有更强的负调控功能。水稻另一个G蛋白γ亚基DEP1,其cys-rich缺失后（dep1）促进分生组织细胞的增殖并增加穗粒数。除了非典型G蛋白γ亚基GS3和DEP1,水稻G蛋白还有一个Gβ亚基RGB1、1个Gα亚基RGA1以及2个典型Gγ亚基RGG1和RGG2。基于以上认识,本研究进一步探索GS3基因的分子作用机理以及所在的G蛋白调控网络,主要研究结果如下:1.在中花11背景下,分别构建了GS3-1与GS3-4融合Flag的超表达转基因材料,其粒长相比较野生型分别减少~12%和~30%。对转基因材料的蛋白含量检测发现,GS3-1-Flag蛋白含量低于GS3-4-Flag。利用蛋白酶体抑制剂MG132对ubi::GS3-1::Flag以及ubi::GS3-4::Flag转基因植株进行处理,发现GS3-1-Flag的蛋白含量上升,而GS3-4-Flag蛋白含量不变,说明GS3-1的cys-rich可能介导GS3的泛素化以及降解。2.遗传转化结果表明,超量表达GS3-1（GS3-1OE）或者抑制表达DEP1（DEP1OE）的转基因植株矮化,密穗且种子变小;相反,抑制表达GS3-1（GS3-1Ri）或者超量表达DEP1（DEP）的转基因植株种子变大,说明GS3与DEP1在种子大小调控方面的功能完全相反。另外超量表达dep1（dep1OE）的转基因植株种子变小,其表型和GS3-1超量表达的植株一致,推测DEP1和GS3可能位于同一调控网络。3.对GS3和DEP1的遗传互作分析发现,在GS3-1OE的背景下超表达DEP1或者敲除DEP1(DEP1ko),种子大小不变;但是在GS3Ri的背景下超表达DEP1种子增大;将dep1的超表达材料与GS3的抑制材料杂交,发现dep1超表达可以完全回复GS3抑制的表型;进一步利用GS3或者DEP1自身启动子驱动dep1,也可以恢复GS3突变体的表型。综合以上遗传材料的分析结果,表明GS3与dep1的功能一致,具有显性负调控DEP1的功能。4.通过CRISPR/Cas9技术,分别构建了敲除GS3(GS3ko)、敲除DEP1(DEP1ko)以及同时敲除DEP1和GS3(GS3koDEP1ko)的突变体。GS3ko突变体种子变大,DEP1ko的突变体种子变小,GS3koDEP1ko双突变体种子大小介于GS3ko和DEP1ko之间,推测可能存在另外一个Gγ基因,其功能与DEP1一致。5.通过序列比对发现,水稻中还存在第三个非典型的G蛋白γ亚基GGC2。对GGC2的功能研究发现,超量表达GGC2使种子变大;相反敲除GGC2使种子变小,说明GGC2是种子大小的正调控因子。通过CRISPR/Cas9技术构建了GGC2koDEP1ko双突变体,其种子比GGC2ko或DEP1ko单突变体的种子小~30%,说明GGC2与DEP1之间的功能具有加性效应。GGC2koDEP1koGS3ko三突变体的种子相对于GGC2koDEP1ko双突变体的种子没有显著增大,说明在GGC2koDEP1ko双突变体背景下敲除GS3没有效应,因此GS3负调控的作用依赖DEP1以及GGC2。6.为了验证Gγ基因GS3、DEP1和GGC2,与Gβ基因RGB1以及Gα基因RGA1的遗传关系,构建了中花11背景下RGB1抑制以及RGA1敲除的突变体,其转基因植株的种子都变小。在RGB1抑制或者RGA1敲除的背景下,超量表达DEP1、GGC2或者抑制GS3,不能使种子显著变大,说明RGB1以及RGA1是DEP1以及GGC2发挥功能所必须的。通过酵母双杂交、体内Bi FC以及荧光素酶互补实验证明GS3、DEP1以及GGC2通过OSR结构域与RGB1相互作用。进一步,酵母三杂交实验表明GS3、DEP1和GGC2之间竞争结合RGB1。体内实验也证实RGB1与DEP1或者GGC2的互作在GS3-1超量表达的背景下减弱,在GS3-4超表达背景下进一步减弱,与GS3-4超表达植株积累更多的GS3-4蛋白相关。7.GS3、DEP1和GGC2的序列比对表明,OSR结构域非常保守,但是cys-rich结构域变异很大。将GS3的cys-rich替换成DEP1的cys-rich或者GGC2的cys-rich,超表达该嵌合基因,种子变大,与GS3原有功能相反;相反,将DEP1的cys-rich或者GGC2的cys-rich替换成GS3的cys-rich,超表达这些嵌合基因,种子变小,与DEP1以及GGC2的原有功能相反。以上结果证明,cys-rich的变异决定了GS3、DEP1以及GGC2蛋白的功能分化。进一步序列分析发现DEP1以及GGC2的cys-rich含有保守的重复序列元件,而在GS3中因缺少该重复元件导致其cys-rich较短,说明重复序列的插入可能是GS3与DEP1/GGC2功能分化的原因。8.序列分析还发现拟南芥Gγ蛋白AGG3与GS3一样不含有保守重复序列。转基因功能验证表明,AGG3在水稻中功能与GS3一致,超量表达植株种子变小,并且其功能只依赖于其OSR结构域;而在拟南芥中,GS3、DEP1以及GGC2都可以回复agg3突变体的表型,说明cys-rich结构变异引起的功能分化只发生水稻中,而在拟南芥中不存在。综上,本研究系统解析了水稻G蛋白各个亚基在水稻种子大小调控中的遗传关系。G蛋白γ亚基通过cys-rich结构域的变异出现了功能分化,其中DEP1以及GGC2的cys-rich结构域介导G蛋白的信号传导,其功能的发挥依赖RGB1和RGA1,而GS3通过OSR结构域竞争结合RGB1,终止DEP1/GGC2的作用。GS3-1的cys-rich同时又介导GS3蛋白的降解,达到对这个系统的精确调控。