背景心肌梗死（Myocardial Infarction,MI）是常见的心血管急危重症,起病急,预后差,严重影响国民的身体健康。MI是在冠状动脉病变的基础上,冠状动脉的血流急剧减少或中断,引起心肌组织急性、持续性的缺血性心肌坏死。同时,心肌细胞损伤会引起心肌局部持续的炎症和纤维化,从而引起心脏收缩和舒张功能障碍。目前与心肌梗死相关的研究主要集中在细胞凋亡、线粒体功能障碍、炎性因子、免疫反应等领域。尽管这些领域已经开展了大量相关研究,但心肌梗死发生发展机制仍未阐明。CREB是一种细胞转录因子,能和c AMP反应元件的特定DNA序列结合,从而影响基因的转录。CREB5是CREB蛋白家族的一员,先前的研究发现CREB5在调节肿瘤细胞生长、增殖、分化中起着至关重要的作用。已确认CREB5在几种类型的人类癌症中均表达升高,如卵巢癌、肝细胞癌和前列腺癌。人肝细胞癌细胞中CREB5可促进细胞增殖和迁移。此外,CREB5可调控直肠癌细胞的细胞凋亡。我们前期针对心肌梗死后患者心肌组织的单细胞测序结果发现CREB5在心肌细胞中表达明显升高,然而CREB5在心肌梗死疾病进程中发挥的作用及机制仍然未知。方法1.实验组（心肌梗死后心力衰竭行心脏移植患者）及对照组（意外死亡志愿捐献）人来源心肌组织均由心血管病国家重点实验室友情提供,取左心室前壁全层心室壁组织（每组3份）,免疫荧光染色检测样本中CREB5阳性心肌细胞比例。12只8周龄雄性C57/BL小鼠随机分为假手术组（Sham,n=6）和心梗组（MI,n=6）。根据分组选择是否结扎小鼠冠脉左前降支,4周后获取小鼠左心室前壁全层心室壁组织,荧光定量RT-PCR、Western blot及免疫组化检测CREB5表达情况。2.提取并培养乳鼠原代心肌细胞,缺氧24h后检测心肌细胞CREB5表达情况。细胞实验分为2组进行:normal组（心肌细胞置于37℃,5%CO2的正常培养箱）、hypoxia组（心肌细胞置于95%N2、5%CO2的培养箱）。荧光定量RTPCR检测Creb5m RNA表达水平,Western blot检测CREB5蛋白表达水平。构建sh RNA慢病毒表达载体敲低心肌细胞Creb5基因表达,检测Creb5对缺氧引起的心肌细胞凋亡的影响。细胞实验分组:normal NT组（心肌细胞感染sh NT慢病毒置于37℃,5%CO2的正常培养箱）、hypoxia NT组（心肌细胞感染sh NT慢病毒置于95%N2、5%CO2的培养箱）、normal sh Creb组（心肌细胞感染sh Creb慢病毒置于37℃,5%CO2的正常培养箱）、hypoxia sh Creb组（心肌细胞感染sh Creb慢病毒置于95%N2、5%CO2的培养箱）。荧光定量RT-PCR检测Creb5和凋亡相关基因表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡情况。3.为了进一步探究CREB5在全基因组水平对心肌细胞表达谱的影响,我们分别提取normal NT、normal+sh Creb5、hypoxia NT、hypoxia sh Creb5四个不同处理组心肌细胞的RNA建库并进行转录组高通量测序。4.动物实验准备工作:收集、浓缩、纯化慢病毒,将40只8周龄雄性C57小鼠随机分为4组:sham+NT组（假手术组+注射sh NT慢病毒）、sham+sh Creb5组（假手术组+注射sh Creb5慢病毒）、MI+NT组（心梗组+注射sh NT慢病毒）、MI+sh Creb5组（心梗组+注射sh Creb5慢病毒）,每组各10只。根据分组选择是否结扎小鼠冠脉左前降支并在梗死区边缘注射相应慢病毒,1周后每组各取两只小鼠提取左心室前壁全层心室壁组织,提取组织RNA和蛋白质,荧光定量RT-PCR检测Creb5m RNA表达水平,Western blot检测CREB5蛋白表达水平。5.通过心脏超声分别检测第0、1、2、4周各组小鼠心功能的变化情况。Masson染色检测心肌梗死面积大小。结果1.免疫荧光染色检测发现心肌梗死患者心肌组织标本中CREB5阳性心肌细胞比例高于正常心肌组织,提示心肌梗死后心肌组织CREB5表达升高。Sham组和MI组小鼠心脏组织免疫组织化学染色和Western blot实验的结果显示CREB5在小鼠MI组心脏组织中的表达水平高于Sham组。荧光定量RT-PCR结果显示心肌梗死后Creb5m RNA表达水平高于Sham组。2.荧光定量RT-PCR、Western blot结果显示心肌细胞在缺氧24h后Creb5 m RNA和CREB5蛋白表达明显升高,敲低Creb5基因表达后凋亡相关基因Bax表达明显下降。TUNEL染色结果显示敲低乳鼠心肌细胞Creb5基因表达可以有效减少缺氧导致的心肌细胞凋亡。3.RNA-seq高通量测序分析结果显示正常情况下敲低心肌细胞Creb5表达可引起细胞增殖、凋亡、脂肪酸代谢、组蛋白去乙酰化等相关基因低表达,而缺氧情况下敲低心肌细胞Creb5表达可引起细胞凋亡、脂肪酸合成等相关基因低表达。转录组高通量测序结果显示缺氧时凋亡相关基因Tnfrsf12a、Krt8、Tnfrsf10b、Gabrb3、Trim2在缺氧条件下有显著升高,然而在敲低Creb5表达后均有明显下降。通过荧光定量RT-PCR分析验证了这些凋亡相关基因,均与测序结果相符合。4.荧光定量RT-PCR及Western blot实验结果显示注射sh Creb5慢病毒的心肌组织Creb5m RNA和CREB5蛋白表达水平明显下降,提示浓缩后的sh Creb5慢病毒对心肌组织有良好的敲低效率。5.心脏超声结果显示体内敲低Creb5基因表达可明显改善心肌梗死后小鼠心脏射血分数,延缓心力衰竭发生。同时,Masson染色结果显示心肌梗死后体内敲低Creb5基因表达可减小小鼠心肌梗死面积。结论本研究检测了人和小鼠心肌梗死后心肌组织CREB5表达情况,发现人和小鼠心肌梗死后的心肌组织中CREB5蛋白水平明显升高。体外实验发现缺氧24h会引起心肌细胞Creb5和细胞凋亡相关基因表达明显升高,敲低Creb5基因表达可以抑制缺氧引起的心肌细胞凋亡,转录组高通量测序发现CREB5可能通过调控Tnfrsf12a、Krt8、Tnfrsf10b、Gabrb3、Trim2等凋亡相关基因表达来调控缺氧引起的心肌细胞凋亡。正常情况下敲低心肌细胞Creb5基因表达可引起细胞增殖、凋亡、脂肪酸代谢、组蛋白去乙酰化等相关基因低表达,而缺氧情况下敲低心肌细胞Creb5m RNA水平可导致细胞凋亡、脂肪酸合成等相关基因低表达。体内敲低Creb5表达水平可改善小鼠心肌梗死后心功能,减小心肌梗死面积,一定程度上延缓心力衰竭发展。综上,本研究发现了CREB5在心肌梗死后心肌细胞中表达升高,并通过细胞实验和在体实验初步探究了CREB5在心肌梗死中调控心肌细胞凋亡的机制,这些发现可能会进一步加深我们对心肌梗死分子机制的了解,同时也有望为治疗心肌梗死提供新的治疗靶点。