PTTG是Pei[1]等于1997年采用差异显示PCR等分子生物学技术分离出的新型原癌基因。Pei等在垂体肿瘤细胞中检测到一个长约13 kb的mRNA呈高表达,而在正常垂体细胞中则无表达。体外研究显示,将转染PTTG的成纤维细胞种植于无胸腺裸鼠皮下,3周后形成肿瘤,故将这一基因定名为垂体瘤转化基因。研究发现,PTTG不仅表达于垂体瘤细胞,而且在细胞增殖活性高的正常组织有PTTG的高表达,如睾丸、胸腺和胚胎肝[2]。在正常结肠、肝脏、卵巢、垂体、胰腺、大脑、肾脏、末梢血白细胞等,PTTG只有弱表达甚至检测不到,但在所有被研究的肿瘤细胞(垂体肿瘤、结肠癌、肝癌、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肾癌、白血病等)和肿瘤细胞系(淋巴细胞系、骨髓细胞系、间充质细胞系、上皮细胞系等)中都有高表达[3-9]。Zhang等[10]用RT-PCR等方法检测54例脑垂体肿瘤及其正常脑垂体组织后发现,有46例脑垂体肿瘤PTTG mRNA含量高于对照组50%,其中23例分泌期型脑垂体肿瘤中,浸润至蝶骨的肿瘤PTTGmRNA表达明显高于病变局限在垂体窝的肿瘤。目前,对于PTTG的研究表明,该基因广泛参与了垂体瘤的发生发展的整个过程,对于垂体瘤的生成起到了关键作用。RNA干扰技术是目前新兴且日益成熟的的基因沉默技术,目前已被认为是基因工程学领域的非常有效率的研究工具。用此技术可以高效稳定特异地阻止目标基因的表达,从而达到较为理想的沉默效果[11-12]。目前,dsRNA,特别是siRNA已被广泛而成功地应用于诸如基因功能研究以及疾病病因与治疗研究等多个领域[13-16]。在针对原癌基因设计的基因治疗策略中,RNAi基因抑制效果确切,应用微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上,甚至可以达到基因敲除的效果[17];其次,RNAi的抑制具有严格的序列特异性,治疗的针对性强,应用此技术能够同时抑制多个不同基因而不致相互干扰[18];RNAi的作用具有级联式放大效应和高穿透性[14],更适合恶性肿瘤的实验研究,RNAi技术在肿瘤的基因治疗上具有光明的应用前景。对多种肿瘤细胞系的研究也证实:肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制,化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效的抑制内源性RNA的表达。本研究旨在通过设计能够在垂体瘤细胞中稳定高效表达的PTTG-shRNA慢病毒重组载体,研究该重组载体对于垂体瘤细胞中PTTG的干扰效果,并进一步明确干扰前后,垂体瘤细胞的生长周期与凋亡水平变化,以期探讨PTTG是否可成为未来进行垂体瘤基因治疗研究的有效靶点。第一部分目的基因RNA干扰慢病毒载体制备与RNA干扰有效靶点筛选本实验运用公众网站设计软件,针对目的基因rPTTG靶基因序列,设计四组shRNA干扰靶点序列,分别标记为1#,2#,3#,4#,并构建成为vshRNA重组载体,将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞,对长出的克隆先进行PCR鉴定,然后进行测序比对。结果显示,四组shRNA重组载体被成功构建,测序无误。制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提,按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。本研究将四组已经构建成功地慢病毒重组载体在工具细胞(鼠肾细胞)中分别进行转染,转染成功后检验四组重组载体的转染效率,从而从中寻找出最高效的shRNA病毒。方法简介如下:培养生长状态良好的目的细胞(即NRK细胞),病毒感染前一天将目的细胞分入12-well培养板培养,感染当天按实验设计的分组情况加入不同MOI的RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP/RFP表达情况,4-5天后采用Real Time-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。结果显示,四个靶点均有敲减效果,其中在高MOI时,2#,3#,4#能够达到70%以上的敲减效率,4#是最佳的靶点。比较高低MOI的数据可以看到,高MOI时,敲减的效果更好,但NC对照组与未感染组的差异大于低MOI时的差异。本部分实验成功构建了四组特异性针对rPTTG1的shRNA慢病毒载体,RNAi慢病毒的包装也同时完成,并在293T细胞中完成病毒包装后的滴度标定。通过该部分试验,我们成功的从四组重组载体中筛选出高效率的靶点,并明确不同MOI值得非特异的毒性差异,为下一步选用最高效率的重组载体对垂体瘤细胞GH3进行转染提供了可靠的依据。第二部分RNA干扰目的细胞效果测定通过前一部分试验,我们成功构建出四组特异性针对rPTTG基因的vshRNA重组载体,并在工具细胞(NRK细胞)中对四组重组载体的转染效率和沉默效果进行评价,从而成功从中筛选出4#为最佳靶点,因此,在后续试验中,我们采用4#慢病毒重组载体,在生长状态良好的GH3细胞中进行慢病毒转染,简要介绍如下:培养生长状态良好的目的细胞(即GH3细胞),病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养,感染当天按实验设计的组别分别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况,感染5天后收集细胞,采用real time-PCR的方法检测目的基因的mRNA表达情况,进而判断干扰效果。试验结果显示,4#vshRNA重组载体能够成功的转染进入垂体瘤细胞GH3中。Real time PCR结果显示该重组载体对GH3细胞中pttg基因的表达有显著敲减作用。敲减效率＞70%,western-blot结果同样显示了类似的结果。同时,与空白对照组以及非特异病毒对照(NC)组的比较中,我们可以看到在稳定转染5天以后,4#重组载体转染组的细胞开始出现片状堆积,细胞变性的变化,8天后,较其它两组对照细胞,4#重组载体转染组出现大面积的细胞凋亡的现象。第三部分RNA干扰前后细胞生物学行为的变化在垂体瘤细胞中成功干扰PTTG基因后,PTTG的RNA水平和蛋白水平上都有了极大幅度的沉默,同时,在肉眼观察下,我们也看到了成片的垂体瘤细胞在PTTG被沉默后出现了变性,凋亡的现象。为进一步明确在PTTG被沉默后垂体瘤细胞的生物学行为是否出现变化,我们分别采用了MTT办法和流式细胞办法,检测垂体瘤细胞在PTTG基因沉默前后细胞生长周期和凋亡水平的改变,简要介绍如下:(1)MTT方法检测RNA干扰前后细胞增殖水平变化:培养生长状态良好的目的细胞(即GH3细胞),病毒感染前一天将目的细胞分入96-well培养板培养,感染当天按实验设计的分组情况加入不同干扰(空白对照,无意义对照以及阳性病毒)进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP/RFP表达情况,4-5天后进行MTT分析,检测有效RNAi靶点干扰后的垂体瘤细胞增殖水平变化。(2)PI染色流式细胞仪检测RNA干扰前后细胞凋亡水平变化:培养生长状态良好的目的细胞(即GH3细胞),病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养,感染当天按实验设计的分组情况加入不同干扰(空白对照,无意义对照以及阳性病毒)进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP/RFP表达情况,4-5天后进行PI染色流式细胞仪分析,检测有效RNAi靶点干扰后的垂体瘤细胞凋亡水平变化。结果:(1)沉默组的细胞生长曲线较其它两组细胞(空白对照组以及NC组)在48h后丌始出现明显的延缓现象,这一结果提示在PTTG被沉默后,垂体瘤细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力明显被抑制。(2)通过PI染色流式细胞方法检测转染沉默前后细胞群体中各时期细胞的比例,我们发现,与其它两对照组比较,在PTTG被沉默以后,垂体瘤细胞群体中,凋亡细胞所占的比例大幅度增加。众多研究表明,多数疾病的发生发展与基因突变及修饰有关,如何特异性进行致病基因的修复或删除,是目前基因治疗研究领域的热点。RNAi技术被发现并逐渐阐明以来,该技术日益成为基因治疗研究方向最常被运用的工具。这归功于该技术具有基因治疗所必需的高特异性和高效性。这些特性也正是以往被运用于基因治疗研究的其它技术所无法达到的[19]。同时需要提到的是,与很多以往的基因治疗方式一样,如何使RNAi效果能够稳定长期的在细胞中实现是目前将RNAi技术运用于疾病基因治疗的难点[20]。在本研究中,我们采用了慢病毒载体系统针对PTTG基因构建了shRNA重组载体,并成功在大鼠垂体瘤细胞株中实现了高效、特异、稳定的PTTG沉默效果。该基因被沉默后,我们看到垂体瘤细胞出现了显著的增殖周期迟缓,凋亡比例大幅增加,细胞片状堆积死亡等生物学行为的变化。基于以上实验结果,我们认为PTTG的确在垂体瘤细胞的生存和增殖过程中起到了关键的作用,PTTG可以成为未来垂体瘤基因治疗的有效靶点之一,同时我们认为,慢病毒载体系统作为基因治疗的载体构件,能够协助shRNA片段在细胞内实现RNAi效应高效稳定的表达,是进行基因治疗研究时非常理想的载体工具。