研究背景和目的神经系统疾病和创伤严重影响人类生命健康和生活质量,目前的治疗方法疗效甚微,不能使病变损伤的神经细胞和神经纤维再生和恢复功能。干细胞是具有自我更新和向多种成体细胞类型分化能力的细胞,干细胞移植治疗神经系统疾病和创伤,最有可能从病理改变和基本发病机制来治愈这类疾患,从而为患者的康复和痊愈带来新的希望。干细胞移植治疗研究中常用的成体干细胞有神经干细胞(neural stem cells,NSCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。考虑到细胞取材来源、治疗安全性和伦理学等相关临床应用价值问题,成体间充质干细胞,特别是脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)和围产期间充质干细胞未来发展空间较大。神经系统含有多种类型和功能的神经元和神经胶质细胞,构成了复杂的网络。就某种神经系统疾病而言,多数情况下只是某一种特定类型的神经细胞发生了病变,需要进行有针对性的替换移植治疗。在特定体外诱导条件下,MSCs可以向神经细胞(神经元和胶质细胞)方向诱导分化。随着基因治疗的兴起,为了给移植的MSCs导入治疗基因,需要对某种特定类型的神经细胞进行修饰。因此,神经系统疾病的间充质干细胞移植治疗和基因治疗针对某一特定类型细胞的精确导向性是非常必要的。无组织细胞特异性的病毒启动子(例如,人类巨细胞病毒启动子 CMV promoter human cytomegalovirus immediate early promoter, CMV promoter)驱动目的基因在所有类型细胞表达,会产生很大的副作用,并且目的基因表达会逐渐衰减甚至消失。常见的神经细胞特异性表达蛋白有突触素Ⅰ(synapsin Ⅰ,SYN1)、胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)等。总之,为了监测MSCs神经分化状态和避免基因治疗的副作用,需要使用细胞特异性启动子来调控目的基因在特定类型细胞表达。铁蛋白(ferritin)是细胞内贮铁蛋白,具有亚铁氧化酶活性,被开发用来作为MRI的内源性显像分子,检测灵敏度高。铁蛋白是人体固有的内源性蛋白,过表达对细胞生长没有影响,无毒性和免疫原性。铁蛋白能够增加细胞铁摄入和细胞内铁含量,使细胞内外铁重新分布,则导致细胞内外磁场强度不均匀性,组织细胞的T2弛豫时间缩短,缩短的程度与铁蛋白的表达量成正相关,T2弛豫时间与MRI图像亮度成正相关。MRI是无创性成像技术,结合铁蛋白造影功能能够用来连续、实时动态地跟踪移植入体内的干细胞。MSCs就供者和受者而言,都存在个体差异,欲达到可靠和满意的治疗效果,就必须准确地监测和跟踪移植到受者体内的MSCs。由于MSCs在神经系统修复和再生中有重要的临床意义,而当前MSCs移植后在体内的迁移分布、生长和分化等情况并不清楚,限制了 MSCs的临床应用,并且MSCs修复神经系统病变损伤的分子生物学机制也有待进一步研究。以往对铁蛋白作为MRI内源性显像分子跟踪干细胞体内迁移的研究文献报道较多,而神经细胞特异性启动子调控铁蛋白表达来监测MSCs的生长和分化状态的研究则未见报道。本课题的研究目的是结合神经细胞特异性启动子技术和铁蛋白内源性MRI标记物技术来标记人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hADMSCs)hADMSCs,检测神经细胞特异性启动子调控铁蛋白特异性表达的作用,进而监测hADMSCs在体外向神经方向诱导分化状态,为进一步的体内实验监测hADMSCs的生物安全性和诱导分化状态提供一定的理论依据。方法1获取目的基因模板培养K562细胞和U251细胞,分别提取总RNA和基因组DNA作为模板,设计引物,PCR法扩增人铁蛋白重链(human ferritin heavy chain,hFTH1)编码区序列和GFAP、MBP启动子序列;PCR产物经纯化后分别连接到T载体,转化到大肠杆菌株DH5α,氨苄青霉素抗性筛选培养,小量提取质粒,菌落PCR初步筛选,测序,结果与NCBI公布的序列进行BLAST比对验证。2构建重组表达载体2.1扩增目的基因序列引入相关酶切位点利用上述测序结果正确无误的T载体质粒作为模板,扩增hFTH1序列,在其5’端和3’端分别引入Mlu I和Cla I酶切位点;扩增hGFAP启动子序列,并将其3’端的第33个核苷酸A突变为核苷酸T,在其5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和Mlu Ⅰ酶切位点;扩增hMBP启动子序列,在其5’端和3’端分别引入Mfe Ⅰ和MluⅠ酶切位点。利用包含CMV或hSYN1启动子序列的质粒作为模板,分别扩增CMV和hSYN1启动子序列,在其5’端和3’端分别引入EcoRⅠ和MluⅠ酶切位点。2.2构建重组表达载体pLVTHM-H1-hFTH1(半成品)用限制性内切酶Mlu Ⅰ和Cla Ⅰ分别双酶切载体pLVTHM质粒(使其线性化)和hFTH1序列PCR产物,前者大片段酶切产物和后者酶切产物进行连接,即得到 pLVTHM-H1-hFTH1 载体。2.3构建重组表达载体(成品)用限制性内切酶EcoRⅠ和MluⅠ双酶切pLVTHM-H1-hFTH1载体,回收大片段酶切产物;根据2.1段所述的酶切位点,分别用相应的限制性内切酶双酶切4个启动子序列PCR产物。前者大片段酶切产物和后者酶切产物进行连接,即将pLVTHM-H1-hFTH1载体的H1启动子序列分别替换为前述4个启动子序列,得到4个重组表达载体,其中1个为组成性表达(无组织细胞特异性)铁蛋白表达载体,命名为pLVTHM-CMV-hFTH1,另3个为神经细胞特异性铁蛋白表达载体,分别命名为 pLVTHM-hSYN1-hFTH1、pLVTHM-GFAP-hFTH1、pLVTHM-MBP-hFTH1。转化到DH5α大肠杆菌株,氨苄青霉素抗性筛选培养,小量提取质粒,EcoRⅠ和MluⅠ双酶切初步筛选,测序,结果与NCBⅠ公布的序列进行BLAST比对验证。3中量提取质粒测序正确无误的4种重组表达载体、pLVTHM载体(空白载体对照)、psPAX2(包装质粒)和pMD2.G(包膜质粒)共计7种质粒(菌株),扩增培养,中量提取质粒。4 DNA-磷酸钙共沉淀转染HEK-293T细胞包装慢病毒上述4种重组表达载体和pLVTHM载体(空白载体对照),分别与psPAX2和pMD2.G按照适当比例瞬时共转染HEK-293T细胞来包装慢病毒,超滤浓缩,梯度稀释感染HEK-293T细胞观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)阳性细胞百分率来测定慢病毒滴度,得到5种慢病毒,命名与相应的重组表达载体相同。5构建稳定感染慢病毒hADMSCs细胞株用含有10%FBS、2mM谷氨酰胺、10mM HEPES的高糖DMEM培养液于37℃、5%C02、饱和温度条件下培养hADMSCs。分别用5种慢病毒以合适的感染复数(multiplicity of infection, MOI),硫酸鱼精蛋白(protamine sulfate)作为助转染剂,感染hADMSCs,观察GFPP阳性细胞百分率,确保感染率达到70%以上,必要时调整优化感染方法或利用GFP标记进行流式细胞分选技术筛选G FP阳性细胞。各组hADMSCs名称和编号叙述如下,1 hADMSCs; 2 hADMS Cs-pLVTHM; 3 hADMSCs-pLVTHM-CMVpromoter-hFTH1; 4 hADMSCs- pLVT HM-hSYN1promoter-hFTH1; 5 hADMSCs-pLVTHM-hGFAPpromoter-hFTH1; 6 hAD MSCs-pLVTHM-hMBPpromoter-hFTH1; 7 hADMSCs-pLVTHM-hSYN1promoter-h-F TH1-induced to neuron; 8 hADMSCs-pLVTHM-hGFAPpromoter-hFTH1-induced t o astrocyte; 9 hADMSCs-pLVTHM-hMBPpromoter-hFT-H1-induced to oligodendr oc-yte。第4、5、6组hADMSCs分别感染了神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性启动子调控铁蛋白表达慢病毒,再分别向相应细胞类型诱导,即分别得到了第7、8、9组hADMSCs。各组hADMSCs在检测铁蛋白表达、细胞内铁含量和MRI体外成像的前72h,在培养液中添加柠檬酸铁铵至终浓度200μM,为细胞合成铁蛋白提供铁源。6 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测慢病毒感染对hADMSCs增殖的影响空白对照组hADMSCs和5组稳定感染hADMSCs(即前6组)以适当密度接种于九十六孔板进行培养,用CCK-8法检测各组hADMSCs在接种后24h、48h、72h和96h的OD450,每组hADMSCs每个时间点设置3个平行孔。7诱导hADMSCs分别向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化7.1 hADMSCs向神经元诱导hADMSCs 用含有 1.0mM β-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol,β-ME)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的 Neurobasal 培养液预诱导24h;用含有3mM beta-ME、10%FBS的Neurobasal培养液诱导48h。7.2hADMSCs向星形胶质细胞诱导hADMSCs 用含有 20ng/ml 表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、20ng/ml bFGF、100U/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素、2mM L-谷氨酰胺(L-Glutamine)和1%N2增补剂的高糖DMEM培养液预诱导3d;用含有1mM N6,2’-O-二丁酰基腺苷 3,5’-环磷酸钠盐(N6,2’-O-Dibutyryladenosine 3’,5’-cyclic monophosphate sodium salt, dbcAMP) 、 0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)、5ng/ml 人血小板衍生生长因子PDGF(human platelet derived growth factor, hPDGF)、50ng/ml 人神经调节素1-β1(human neuregulin 1-beta1/HRG1-betal EGF Domain)、20ng/ml hbFGF、100U/ml青霉素、10Oμg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养液诱导3d。7.3 hADMSCs向少突胶质细胞诱导hADMSCs 用含有 20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF、1% N2 增补剂、2mML-谷氨酰胺的Neurobasal A培养液预诱导培养48h;用含有500ng/ml IGF,50ng/ml NT-3,5ng/ml PDGF、1% N2 增补剂的 Neurobasal A 培养液诱导培养 3d。7.4神经细胞特异性标志物免疫荧光法检测诱导后的hADMSCs分别用免疫荧光法检测nestin、NSE(神经元)、GFAP(星形胶质细胞)和MBP(少突胶质细胞)神经细胞特异性标志物的表达,判定向神经细胞诱导分化是否成功。8免疫荧光法检测各组hADMSCs铁蛋白表达9 qRT-PCR 检测各组 hADMSCs hFTH1 mRNA 表达10 western blot检测各组hADMSCs铁蛋白表达11普鲁士蓝染色法定性观察各组hADMSCs细胞内铁含量和分布12 ICP-MS法定量检测各组hADMSCs细胞内铁含量各组hADMSCs(每组约1×106个细胞),消解细胞制备样品溶液,检测铁含量,再除以每组细胞数量,得到各组hADMSCs的单个细胞内铁含量。13各组hADMSCs MRI体外成像将各组hADMSCs(每组106个细胞)包埋于1 %琼脂糖-PBS凝胶中,场强3.0T MRI成像检测各组hADMSCs T2。14统计分析采用SPSS13.0统计软件对定量实验结果进行分析,计算计量资料每组(每个条件)的平均数和标准差,表示为(x±s)。方法6的结果采用析因方差分析(双因素,组别和培养时间),分析双因素的主效应和交互效应,同一因素各个水平之间平均数采用单向方差分析(one way ANOVA)进行比较,若方差齐性取F值,若方差非齐性则采用Welch值,多重比较若方差齐性采用LSD检验,若方差非齐性采用Dunnett’sT3法。方法9、10、12和13的结果采用单向方差分析比较各组平均数差异,双变量相关分析(Spearman相关系数)分别分析4个实验结果之间的相关性。显著性水准均为P<0.05,表示比较各组间平均数有统计学意义差异。结果:1构建重组表达载体构建4种重组表达载体的测序结果与NCBI公布的序列和实际设计序列进行BLAST比对验证,正确无误。2包装慢病毒包装5种慢病毒经过浓缩,测定滴度2×108-6×108范围内。3构建稳定感染hADMSCs细胞株构建5种稳定感染hADMSCs细胞株,GFP阳性细胞百分率为60%-70%。4 CCK-8法检测慢病毒感染对hADMSCs增殖的影响空白对照组hADMSCs和5组稳定感染hADMSCs(即前6组)在CCK-8法监测相同时间点各组OD450平均值无统计学意义差异(主效应F=2.622,P=0.036;24h F=2.062, P=0.141; 48h F=2.184, P=0.124; 72h F=0.158, P=0.973; 96h F=0.607, P=0.697);每组hADMSCs在不同时间点OD450平均值有统计学意义差异,随着培养时间的推移逐渐增高,(主效应F=226.620, P<0.001,第1组,F=554.972,P<0.001;第 2 组,F =2049.169,P<0.001;第 3 组,F=585.452,P<0.001;第 4 组,F=633.111,P<0.001;第 5 组,F=524.362, P<0.001;第 6组,F=1525.607, P<0.001)。双因素(组别和培养时间)之间无交互效应(F=1.054,P<0.421),生长曲线表现为典型的对数生长期和平台期,表明慢病毒感染对hADMSCs增殖无影响。5诱导hADMSCs向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化nestin红色荧光由强阳性到微弱阳性,NSE红色荧光由微弱阳性到强阳性,表明hADMSCs向神经元诱导分化成功;GFAP红色荧光由微弱阳性到强阳性,表明hADMSCs向星形胶质细胞诱导分化成功;诱导hADMSCs向少突胶质细胞诱导分化,MBP红色荧光由微弱阳性到强阳性,表明hADMSCs向少突胶质细胞诱导分化成功;6免疫荧光法检测各组hADMSCs铁蛋白表达各组hADMSCs均观察到铁蛋白红色荧光,表明均有铁蛋白表达,第1、2组均微弱表达,第3组表达较前2组增加;第4、5、6组表达较第1组增加,但是弱于第3组;第7、8、9组分别与第4、5、6组相比表达明显增加。7 qRT-PCR 检测各组 hADMSCs hFTH1 mRNA 表达各组 hADMSCs hFTH1 mRNA 2-△△Ct 平均值分别为 1.000±0.000、1.076±0.026、1.549±0.314、1.452±0.316、1.280±0.164、1.199±0.104、5.997±0.445、7.130±0.683和5.744±0.369,各组平均数有统计学意义差异(F=169.029,P<0.001)。第7、8、9组分别与第4、5、6组相比表达明显增加,表明诱导分化过程开启激活或增强相应神经细胞特异性启动子功能,使hFTH1基因转录水平明显增高。8 western blot检测各组hADMSCs铁蛋白表达各组hADMSCs铁蛋白表达半定量水平分别为0.400±0.003、0.460±0.011、0.676±0.012、0.541 ±0.022、0.503±0.007、0.606±0.010、1.224±0.002、1.250±0.018和1.032±0.014,各组平均数有统计学意义差异(F=2150.319, P<0.001)。第7、8、9组分别与第4、5、6组相比表达明显增加,表明诱导分化过程开启激活或增强相应神经细胞特异性启动子功能,使铁蛋白表达水平明显增高。9普鲁士蓝染色法定性检测各组hADMSCs细胞内铁含量和分布各组hADMSCs均可见细胞内蓝色颗粒,表明均有铁蛋白表达,摄取并且结合了细胞外铁。第1、2组见少量散在细胞内蓝色颗粒,第3组蓝色颗粒较前2组增加;第4、5、6组蓝色颗粒较第1组增加,但是少于第3组;第7、8、9组蓝色颗粒分别与第4、5、6组相比明显增多,成片分布。10ICP-MS法定量检测9组hADMSCs细胞内铁含量各组 hADMSCs 细胞内铁含量(pg/cell)分别为 48.861±0.297、58.583±0.789、126.264±0.653、145.771±0.634、58.267±0.702、67.556±0.416、468.441±0.572、668.652±0.739和444.308±0.527,各组平均数不相同,差异有显著性和统计学意义(F=433247.6, P<0.001)。第7、8、9组细胞内铁含量分别与第4、5、6组相比明显增加,说明诱导分化过程开启激活或增强相应神经细胞特异性启动子的功能,使人铁蛋白基因转录水平明显增高,进而使人铁蛋白翻译合成水平大幅度增高,摄取并且结合了大量的细胞外铁,使细胞内铁含量大幅度增高。11各组hADMSCs体外MRI检测T2各组 hADMSCs T2 值分别为 212.75±33.00、173.25± 10.81、133.75±30.14、123.25±10.72、101.25±14.66、174.00±23.24、35.25±3.30、27.50±4.12 和28.25±11.41,各组平均数不相同,差异有显著性和统计学意义(F=55.147,P<0.001)。第7、8、9组T2值分别与第4、5、6组相比明显减低,说明诱导分化过程开启激活或增强相应神经细胞特异性启动子的功能,使人铁蛋白翻译合成水平大幅度增高,使细胞内铁含量大幅度增高,导致细胞内外磁场强度不均匀性,使T2明显减低。12双变量相关分析hADMSCshFTH1 mRNA表达结果与铁蛋白表达、细胞内铁含量、T2结果之间的 Spearman 相关系数分别为 0.950(P<0.001)、0.933(P<0.001)、-0.900(P=0.001);铁蛋白表达结果与细胞内铁含量、T2结果之间的Speaman相关系数分别为0.933(P<0.001)、-0.783(P=0.013);细胞内铁含量结果与T2结果之间的Spearman相关系数为-0.800(P=0.010),表明4个实验结果存在统计学意义相关性(T2结果与其他3个结果呈现负相关性),各个实验结果能够互相印证。结论和创新点:本研究首次证明了神经特异性启动子能够调控铁蛋白作为内源性MRI标记物在hADMSCs进行相对特异性表达,导致hADMSCs MRI T2改变,从而将hADMSCs体外神经细胞方向分化状态和MRI联系起来,可以利用MRI监测hADMSCs向神经细胞方向分化状态。展望在本研究的基础上,在体内实验应用MRI监测体内移植hADMSCs神经诱导分化状态;应用特异性更高的启动子和其他相关特异性启动子来研究hADMSCs移植治疗机制和生物安全性。