单宁酶产生菌的筛选、发酵优化及酶的纯化研究

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本研究涉及单宁酶产生菌的分离筛选、单宁酶发酵培养基组分和发酵条件优化、酶的纯化以及酶学性质研究,主要研究结果如下:经过平板初筛和固体发酵复筛,从土壤样品中分离出一株高单宁酶产率的真菌菌株CY-3,经菌落特征和显微形态观察,初步鉴定其属于曲霉属。对菌株CY-3产单宁酶的培养基组分和发酵条件进行了单因素和响应面优化。结果表明,最适培养基组分和发酵条件为:以5g麸皮为固体基质,按固液比1:1.5(g/mL)添加盐溶液(组成为:单宁酸59.4 g/L,葡萄糖30g/L,NaNO3 6 g/L,NaH2PO4 1.5 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, KC1 0.5 g/L, FeSO4·7H2O 0.01 g/L, pH5.26),20%(v/w)接种量,在32.6℃下发酵60h。在上述条件下,单宁酶活力达到84.90 U/gds,为优化前的9.38倍。利用双水相萃取技术纯化单宁酶并优化工艺参数。结果表明,在18%(w/w) PEG 600/24%(w/w)柠檬酸钠/20%(w/w)酶液的双水相系统(pH7.0)中,单宁酶的纯化倍数为5.31倍,酶活回收率86.70%。该系统放大10倍后,单宁酶的酶活回收率和纯化倍数没有显著变化。酶学性质研究结果表明,菌株CY-3所产单宁酶的最适反应温度为70℃,在50℃下放置28 h后酶活力仍保留80%以上;最适反应pH为7.0,在pH5.0-7.0范围内具有很好的稳定性。1mM的Na+、Ba2+、Ca2+、Mg2+和K+对单宁酶具有激活作用,而Ag+和Fe2+具有抑制作用。甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、丙三醇、异辛烷、正丙醇和异丙醇(1%,v/v)均能抑制单宁酶活性,其中异辛烷的抑制率达27.64%。SDS和EDTA在1mM浓度下可抑制单宁酶活力,而1%(v/v)的Tween 80和Triton X-100对单宁酶活性的影响较小。
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