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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的病毒性传染病,以成年母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征。2006年5月份开始,主要由PRRSV Nsp2缺失变异株引起的以高热、呼吸困难为主要症状,高发病率和高死亡率为显著特征的猪“高热”综合征,给我国南方养猪业带来巨大的经济损失的。准确、可靠的检测技术和安全、高效的疫苗是预防和控制PRRS的关键,也是目前猪病研究的热点。本研究从四川发病猪场分离鉴定一株PRRSV Nsp2缺失变异株,建立了对PRRSV Nsp2缺失变异株的病原学和血清学检测方法,克隆出猪前胸腺素(ProTa),并将其作为分子佐剂,构建携带GP5-ProTa融合基因的减毒沙门氏菌活载体疫苗,初步取得了如下研究结果：1.猪繁殖与呼吸综合征病毒SCMS08株分离鉴定用Marc-145细胞分离了PRRSV四川变异株(SCMS08株),对其生物学特性进行了初步研究。通过对其Nsp2高变区和GP5全基因进行了序列测定,发现与JXA1株同源性最高,核苷酸和推导氨基酸同源性分别高达99.7%、99.8%和99.2%、99.3%。遗传进化树分析显示所分离毒株与JXA1等为代表的PRRSV Nsp2缺失亲缘关系最近。2.对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立及四川PRRSV遗传进化分析利用生物学软件设计三对特异性检测引物,成功建立能够同时检测PRRSV欧洲株,美洲经典株和Nsp2缺失变异株的多重RT-PCR方法。并用所建立的方法对四川各地送检的76份PRRS疑似病料进行检测,结果PRRSV总的检出率达到60%,其中变异株为53.9%,未检出欧洲株。在检测出的阳性病料中选取有代表性的9株病毒,对其Nsp2高变区进行克隆,并进行了序列测定,序列分析结果显示,这9株PRRSV之间同源性极高,与国内分离株JXA1的亲缘关系最局。3. PRRSV Nsp2高变区B细胞优势抗原表位的鉴定及间接ELISA方法的鉴定通过生物信息学方法对SCMS08株Nsp2高变区域二级结构和抗原表位进行预测分析。根据预测结果设计4对引物对Nsp2高变区进行分段克隆,并成功构建4个原核表达载体,经IPTG诱导,均获得高效表达,经SDS-PAGE结果显示4个融合蛋白的大小分别约是63、35、26、27ku,与预期大小一致。Western blot结果显示,4个融合蛋白均能与PRRSV Nsp2缺失变异株阳性血清反应,但其中Nsp2-4反应较弱。在PRRSV SCMS08株Nsp2中部区域发现两个强抗原表位。将4个融合蛋白经镍柱纯化后,分别建立ELISA检测方法。通过对血清样品的检测发现,Nsp2-1、Nsp2-2、Nsp2-3、Nsp2-4对于PRRSV经典株血清样品的识别率分别为84.6%、77.4%、21.3%和52.1%；对PRRSV Nsp2缺失变异株的识别率分别为100%、100%、77.6%和63.2%。以Nsp2-1融合蛋白为包被抗原的ELISA方法对经典株和变异株血清均有较高的敏感性,证明通过Nsp2作为诊断抗原建立ELISA诊断方法可行。为进一步研究区分美洲型PRRSV经典株和Nsp2缺失变异株的血清学方法奠定了基础。4.猪前胸腺素的克隆和表达研究应用RT-PCR技术从猪肾脏中扩增到猪前胸腺素基因,经测序鉴定正确后,构建重组质粒pET-32-mProTa,并转化大肠杆菌(E. coli)Rosetta 2 (DE3)。IPTG诱导表达目的蛋白,初步纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析鉴定结果。猪前胸腺素完整开放阅读框(ORF),共333bp,编码109 aa,与已公布的2个猪前胸腺素基因核苷酸同源性均为99.4%。SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,重组蛋白以包涵体形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的40%,相对分子量约为12 ku。MTT法试验证实,表达产物初步纯化、透析复性后,可明显增强淋巴细胞的增殖。将ProTa连接到pEGFP-N3真核表达载体,构建真核表达载体pEGFP-ProTa。通过脂质体法转染Vero细胞,进行荧光检测。结果显示,构建的pEGFP-ProTa真核表达质粒转染Vero细胞后,经荧光观察EGFP-ProTa融合蛋白有向细胞核聚集的现象。5.减毒沙门氏菌介导的猪ProTα与PRRSV-GP5二联基因疫苗的免疫学研究分别构建了pCI-GP5、pCI-ProTa和pCI-GP5-ProTa真核表达载体。将pCI-GP5、pCI-ProTa和pCI-GP5-ProTa真核载体转染Vero细胞后,采用RT-PCR检测重组载体在Vero细胞中的转录情况；同时通过间接免疫荧光检测方法pCI-GP5和pCI-GP5-ProTa,进一步证实了核酸疫苗在Vero细胞中获得了高效表达。小鼠实验表明pCI-GP5-ProTa免疫组和pCI-GP5、pCI-ProTa联合免疫组小鼠的体液免疫和细胞免疫指标均高于pCI-GP5免疫组。证明ProTa发挥了免疫佐剂作用,大大增强了DNA疫苗的免疫原性,是一种良好的免疫佐剂。同时将pCI-GP5-ProTa转入减毒沙门氏菌C500中,成功构建携带pCI-GP5-ProTa减毒沙门氏菌C500新型疫苗,经小鼠动物实验发现能显著提高小鼠的粘膜免疫及淋巴细胞增殖活性,为PRRSV基因疫苗在生产中的应用提供了理论依据。