脓毒症(Sepsis)是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中,是机体对感染的一种不能控制的全身性炎症反应。炎症反应是感染或非感染因素如细菌感染、外伤、烧伤、较大外科手术等,刺激宿主免疫系统,释放细胞炎症介质,发生的一种临床病理过程。以细胞因子为代表的多种炎症介质的失控性释放,产生过度炎症反应,不仅不能去除机体的致病因素,反而会抑制免疫系统,继续发展可以导致全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒症和多器官功能不全,其共同病理生理特征是自身的免疫失控、体内白细胞大量激活,产生过量的炎症介质而引起全身多个脏器损伤。一氧化碳(carbon monoxide, CO)在机体内由血红素加氧酶(HO)催化血红素产生,过去曾被认为是破坏细胞呼吸作用的有害物质,最近的研究发现CO还是一种气体信号分子,在损伤诱导的各种机体应激中具有保护组织的作用,在心血管、神经和免疫的生理和病理过程中都起着重要的调节作用。我们研究发现CO对炎症反应也具有抑制作用,但其机制尚未明确。在本研究中,我们利用可以在机体内释放CO的一种新型金属—羰基化合物一氧化碳释放分子(tricarbonyldichlororuthenium (Ⅱ) dimer, CORM-2),通过在体实验研究高氧预处理联合外源性CO干预对脓毒症小鼠肺部炎症反应的抑制作用及(部分)分子机制。第一部分盲肠结扎穿孔模型及高氧预处理联合CORM-2的使用方法的建立目的以盲肠结扎穿孔术复制接近于人类腹膜炎引起脓毒症或脓毒性休克的动物模型,明确高氧预处理对脓毒症机体的保护作用及CORM-2的使用方法。方法1)选用6--8周龄清洁级昆明种小鼠,雄性,体重20+2g,均由江苏大学动物实验中心提供。于本实验室(室温25℃)适应性饲养一周。术前禁食12小时。将氧气组小鼠置于通氧气的密闭容器中,予以吸氧30分钟。2)异氟烷吸入麻醉小鼠,自腹中线行约1cm切口,逐层进入腹腔,轻柔快速找出盲肠,提起末端,分离肠系膜,穿细线在盲肠近端结扎,避过系膜血管,用20号针头穿透结扎处远端,自两穿孔处挤出肠内容物少许,回纳肠管至腹腔。3-0手术缝线缝合伤口,腹膜、肌层一同毯边缝合,皮肤层间断缝合。每只鼠腹腔注射等渗生理盐水1.0ml抗休克;单笼饲养,自由进食,足量饮水,切口涂以碘酊抗感染。3)按照试剂规格,每10.25mg CORM-2溶解于500ul DMSO中配制成500ulCORM-DMSO溶液,吸取8ulCORM-DMSO溶液,溶解于152ul等渗生理盐水中,立即用于尾静脉注射。CORM-2要求现用现配。结果本实验室盲肠结扎穿孔术操作科学,模型符合实验要求,高氧预处理后小鼠存活率升高。CORM-2的配制符合实验要求,可安全用于实验。结论脓毒血症是危重病中常见的死亡原因,机体受严重感染或损伤而产生系统性炎症反应综合征(system inflammatory response syndrom,SIRS),进而导致多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrom, MODS)。本实验所采用脓毒症模型操作简便,通过外科处理使动物腹腔存在失活组织的同时,少量持续溢入混有多种细菌的肠内容物,引起腹腔感染。该模型中,动物各项指标检测明确,在机体损伤方面达到了预期的要求,可用于动物实验中炎症反应机制的研究。近年合成的新型一氧化碳释放分子CORM-2通过溶解后释放CO发挥生理作用,在一定生理剂量时并不提高动物体内HbCO的浓度。本实验室不同模型研究证实,CORM-2可被安全有效的用于炎症反应的干预作用相关研究。第二部分高氧预处理联合CORM-2干预对脓毒症小鼠碳氧血红蛋白含量及存活率的影响目的探讨高氧预处理联合CORM-2干预对脓毒症小鼠体内HbCO含量及存活情况的影响,以明确HbCO的表达水平,增加CORM-2的安全有效性,更好的为临床防治脓毒症提供理论指导。方法12只小鼠随机分为三组：CLP模型组、CORM-2组、高氧预处理组。将自制塑料盒氧舱在侧壁上、下分别钻孔后接通急诊氧气袋(氧气取自病房中心供氧装置),O2组小鼠放入盒中通氧气30分钟；制作CLP模型,配制CORM-2并记录打入CORM-2的时间,各组分别在1.5h、3h、6h、24 h记录小鼠存活数量,分别在各时间点采血0.5ml；在4只干净试管中加入等量物质：10mg低亚硫酸钠、10ml配制好的氨水、50ul抗凝血,轻轻混匀；分光光度计选择538nm、578nm波长,于10分钟内测定吸光度值,记录结果,绘制图表。结果本实验结果发现,与模型组比较,CORM-2干预后HbCO%升高；与CORM-2干预组比较,高氧预处理组小鼠HbCO%在1.5h、3h时明显下降(P<0.05)。CLP术后10h至48h,CORM-2组存活率高于CLP模型组；氧气预处理组存活率又明显高于CLP模型组和CORM-2干预组,此后仍然保持在较高水平。结论机体在严重创伤情况下,通过吸入一定浓度的氧气,加速COHb的解离,促进CO的消除,使Hb恢复携氧功能,从而提高血氧分压,增加血氧含量,使组织得到充足的溶解氧,大大减少机体对Hb运氧的依赖性,从而迅速纠正可能存在的低氧血症,有效减轻组织损伤,提高个体存活率。研究表明,在正常情况下,小鼠体内HbCO%保持在一较低水平,CORM-2干预后其含量增加,但远远低于中毒临界值。高氧预处理后HbCO%下降,表明高氧预处理可以有效降低CORM-2干预后机体内HbCO%含量,从而减轻炎症反应早期的组织损伤,发挥保护机体的作用。本实验中,在CORM-2的安全使用范围内,高氧的作用降低了COHb%,加快了CO的消除,最终减轻了CO可能存在的负性作用,增强了其抗炎作用,最终提高了炎症状态下动物的存活率。第三部分高氧预处理联合外源性一氧化碳释放分子(CORM-2)干预对脓毒症小鼠肺脏炎症反应的抑制作用及(部分)分子机制目的采用小鼠盲肠结扎穿孔模型,探讨高氧预处理联合CORM-2干预对严重创伤后小鼠肺脏炎症反应的影响及CORM-2在IKK激活、IκBα降解及NF-κB活化信号通路中的作用靶点,明白其抑制炎症反应的(部分)分子机制。方法雄性昆明种小鼠,30只,随机分为假手术组、CLP模型组、CORM-2干预组、iCORM-2组和高氧预处理组。分别于CLP术后6 h,12 h,24 h麻醉并收集血浆、肺组织标本,处死小鼠。酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法检测血浆中肿瘤坏死因子-α(turner necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎症因子的表达；检测肺组织中髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)活性,观察炎症反应过程中中性粒细胞的聚集程度；测定肺组织湿干重比(wet/dry, W/D);苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色观察肺组织病理变化；免疫组织化学法观察细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecules-1, ICAM-1)、肺表面活性蛋白-A(surfactant protein-A, SP-A)的表达;western-blot法检测IKK-β激活水平；EMSA法检测NF-κB活化水平。结果本研究表明,与假手术组比较,CLP术后小鼠肺组织充血明显,肺泡间质有炎性浸润,肺泡壁增宽,肺泡腔内可见出血和渗出,并随时间的演变,肺组织病理改变逐渐加重;血清细胞因子TNF-α、IL-1β和趋化因子MIP-2表达明显增加；肺组织ICAM-1及MPO等分子生物学指标表达明显增加；SP-A表达明显减少；IKK明显被激活,IκBα降解增多,NF-κB蛋白活性明显增强(P<0.05)；与CLP模型组相比较,CORM-2干预组肺间质水肿程度减轻,白细胞浸润明显减少；促炎症因子的表达明显受抑制;ICAM-1及MPO等表达明显受到抑制；SP-A表达增加;IKK激活、IκBα降解、NF-κB活化信号通路受到抑制(P<0.05)；与CLP模型组比较,iCORM-2组各指标变化均不明显；与CORM-2干预组比较,高氧预处理组血清TNF-α和IL-1β等细胞因子的表达进一步减少;肺组织ICAM-1及MPO表达进一步减少,SP-A表达增多；IKK激活、IκBα降解、NF-κB活化信号通路进一步受到抑制。结论本实验室小鼠脓毒症模型的建立过程规范,操作简单,具有可重复性,且模型的检测指标明确,在机体损伤方面达到了预期的要求,可用于在动物方面研究炎症的反应机制。越来越多的证据表明,急性肺损伤是系统性疾病发生的早期征象。机体严重创伤后,早期对肺损伤作出正确的诊断和治疗对救治危重症患者意义重大。本研究发现,在高氧环境中,使用CORM-2干预使得CLP小鼠在组织形态及功能、各种炎症因子、黏附分子表达等方面都发生了相应的变化,IKK激活、IκBα降解及NF-κB活化信号通路受到不同程度的抑制,显示出高氧预处理后外源性一氧化碳能更明显的抑制炎症反应,这一结果为临床危重病人的救治提供了重要的理论指导,具有重要的临床价值。