第一部分 丝素纳米银支架的制备和检测目的:慢性骨髓炎是一种治疗周期长、易复发、疗效差、致残率高的常见临床疾病。近些年,多重耐药菌株的逐渐增多(尤其是Methicillin-resistant S.aureus,MRSA),使得临床上慢性骨髓炎的治疗更加困难。为了克服现有材料的各种弊端,研发可降解吸收、生物相容性更佳且有抗菌属性的新型材料成为治疗慢性骨髓炎的紧迫任务。为此,我们尝试了一种新工艺用以制备丝素纳米银支架材料,以期用于慢性骨髓炎的治疗研究。方法:我们设计利用丝蛋白与甲酸双还原的特性,将银离子在原位上直接还原生成纳米银颗粒(AgNPs),进而制备不同浓度(0、0.1%、0.5%和1%)AgNPs含量的丝素蛋白支架用作研究和检测。制备的材料分别行扫描电镜、EDS能谱仪、红外光谱和X射线衍射等形态、结构与性能的表征测试。结果:扫描电镜显示不同浓度AgNPs的丝素蛋白支架均具有多孔互连的匀质化结构,孔径大小约为130～460μm,AgNPs能够较为均匀的分散在丝素蛋白支架的表面。EDX能谱清楚地证实了银元素在材料表面的存在。红外光谱分析表明AgNPs对丝蛋白支架的(酰)氨基键没有影响,在制备过程中使用的甲酸和硝酸银对丝素蛋白结构也没有破坏。X光衍射检测进一步证实了我们制备的支架材料是具有稳定晶体结构的多孔丝素纳米银合成物。结论:利用丝蛋白与甲酸的双还原作用,结合致孔剂法可以制备装载AgNPs的丝素蛋白多孔支架材料。制备工艺简便高效。经表征检测,装载的AgNPs未破坏丝素蛋白支架的组织结构,且AgNPs能够较为均匀的分散在丝素蛋白材料的表面。第二部分 丝素纳米银支架的细胞毒性研究目的:为了验证丝素纳米银支架材料的生物相容性,我们拟选取成骨细胞(MC-3T3)作为研究对象,用于体外的细胞毒性实验。系统研究成骨细胞在不同浓度纳米银含量的丝素蛋白支架上的活性及生物学应答。方法:用激光共聚焦显微镜观测MC-3T3细胞在含有不同浓度AgNPs的丝素蛋白支架材料上的生长状况。根据ISO 10993-5标准,通过间接测试检测丝素纳米银支架材料的细胞毒性。将支架材料不同时间段的浸泡液用于干预MC-3T3细胞,分别行CCK-8增殖检测和ALP/Runx2活性蛋白检测。结果:激光共聚焦显示,含有不同浓度AgNPs的丝素蛋白支架均可支持成骨细胞的粘附和生长。成骨细胞在材料上主要沿着多孔支架的轮廓有序生长,细胞形态多为胞体伸长型。CCK-8检测1%浓度AgNPs含量的丝素蛋白支架在浸泡7和10天后(相对增殖率90.5±2.7%和88.9±1.2%)即明显表现出了对MC-3T3细胞的增殖抑制作用。此外,1%浓度AgNPs含量的丝素蛋白支架在浸泡10天后即表现出了对成骨细胞的ALP和Runx2活性抑制。结论:丝素纳米银支架可以支持成骨细胞的粘附和生长。且较低浓度(0.1%和0.5%)AgNPs含量的丝素蛋白支架均表现出了良好的生物相容性。第三部分 丝素纳米银支架对MRSA抗菌活性的研究目的:验证丝素纳米银支架及装载庆大霉素在体外对耐药菌MRSA的抗菌性能。方法:运用Kirby-Bauer抑菌圈法和震荡检测细菌生长曲线法检测不同浓度AgNPs的丝素蛋白支架材料对MRSA的抗菌效果。运用抑菌圈法验证不同浓度AgNPs的丝素支架材料装载庆大霉素的抗菌效果。结果:抑菌圈显示1%浓度AgNPs的丝素蛋白支架可有13.2mm的区域抑制范围,显示出更明显的抗菌性能。生长曲线检测表明1%和0.5%浓度AgNPs的丝素蛋白支架的抑制率分别为77.5%和72.3%,与0.1%浓度AgNPs的丝素蛋白材料(51.8%)相比,抗菌效果明显。丝素蛋白支架+庆大霉素组的抑菌直径16.8mm,不同浓度(0.1%、0.5%和1%)AgNPs的丝素支架材料+庆大霉素对应的抑菌直径为17.4mm、18.4mm和 24mm。结论:丝素纳米银支架对MRSA的抗菌效果有明显的AgNPs浓度或剂量依存性。0.5%和1%浓度AgNPs的丝素蛋白支架对MRSA均有明显的抗菌作用。庆大霉素对ATCC43300菌株有较强的杀伤力。AgNPs和庆大霉素对MRSA的抗菌效果有叠加效应。第四部分 丝素纳米银支架装载庆大霉素治疗MRSA所致大鼠慢性骨髓炎模型的研究目的:为了验证丝素纳米银支架作为生物填充材料治疗慢性骨髓炎的疗效,我们设计丝素纳米银支架装载庆大霉素用于MRSA所致大鼠慢性骨髓炎模型中,以期为为高效治疗慢性骨髓炎探索新的填充材料和药物载体。方法:根据前三部分研究的结果,我们最后选定0.5%浓度AgNPs的丝素蛋白支架用于在体动物模型实验。模型选取大鼠胫骨近段行慢性骨髓炎造模,然后行清创并植入支架材料。实验分五组:1、空白对照组(清创后旷置);2、丝素蛋白支架组;3、丝素蛋白支架+庆大霉素组;4、丝素纳米银支架组;5、丝素纳米银支架+庆大霉素组。从一般状况、影像学、组织学和微生物学等全面评估该支架的治疗效果。结果:所有大鼠慢性骨髓炎造模成功后,体重和食欲都有明显下降,甚至白细胞计数也明显增加。清创并支架植入后,大鼠营养状况明显改善(体重逐渐增加),白细胞计数也逐渐恢复到正常范围。影像学观察空白对照组和丝素蛋白支架组的溶骨性空腔扩大伴骨密度降低、骨皮质破坏和死骨形成;其它治疗组可见局部骨密度恢复及新骨形成。HE染色也表明空白对照组和丝素蛋白支架组有大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润,甚至有脓肿形成和骨细胞坏死和凋亡;丝素纳米银支架组显示炎症和脓肿明显减少,但仍有少量炎性细胞浸润,并伴有骨膜反应。庆大霉素治疗组的炎症和脓肿都明显消退,有骨膜下纤维化和新生血管形成。微生物学检测表明,负载庆大霉素的支架可显著杀灭骨髓炎中的MRSA菌。丝素蛋白支架+庆大霉素组(4×103CFU/g)和丝素纳米银支架+庆大霉素组(3.5×103CFU/g)的细菌负荷明显低于其他组(P<0.01)。此外,丝素纳米银支架组(6.16×105CFU/g)较空白对照组(5.14×106CFU/g)和丝素蛋白支架组(5.85×106CFU/g)也有显著性差异(P<0.01),表明丝素纳米银支架材料本身即可明显抑制大鼠胫骨骨髓腔内的MRSA生长。结论:丝素纳米银支架装载庆大霉素可有效的治疗慢性骨髓炎。丝素纳米银支架可以作为一种潜在的填充材料和药物缓释搭载平台用于治疗慢性骨髓炎。