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目的:构建不同暴露时间和不同暴露剂量的雄性大鼠吸烟模型,评估吸烟对雄性大鼠的生殖毒性,进一步探讨吸烟引起生殖毒性的分子生物学机制;通过Morris水迷宫实验测定不同性别子代空间学习记忆能力的改变,并在分子生物学层面探讨父代吸烟引起子代学习记忆能力改变的机制。方法:SD大鼠300只(雄性200只,雌性100只),根据暴露时间随机分为2、4、6、8、12周,每周组又包括空白对照组(新鲜空气即0支/天)、低剂量组(10支/天)、中剂量组(20支/天)及高剂量组(30支/天),每组10只动物。香烟暴露组雄鼠于吸烟结束前1周分别与未染毒成年雌性大鼠按1∶1合笼,交配时间为一周,怀孕雌鼠自然分娩后连续观察子代生长发育情况,21天后断乳,子代雌雄随机分笼分组,分组方法同父代,每组10只动物,雌雄各半。子代长到7周后结束实验。Morris水迷宫方法测定子代学习记忆能力的变化;HE染色法观察父代睾丸组织和子代海马组织的结构形态;精子涂片法,计算精子数量和精子畸形率;观察和记录雌鼠受孕率和子代出生数量;ELISA法测定父代血清和子代血清中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及瘦素(leptin)的表达水平;测定父代睾丸组织和子代海马组织中SOD活性、MDA含量及GSH-Px活性,测定子代海马组织中NO含量及NOS活性;免疫组织化学法检测Caspase-8、Caspase-3蛋白表达水平;RT-PCR及Western Blot法测定父代睾丸组织中死亡受体Fas/FasL凋亡通路中及wnt/β-catenin增殖通路上相关基因mRNA和蛋白表达水平;子代海马组织中wnt/β-catenin相关基因mRNA和蛋白表达水平。TUNEL法测定子代海马组织中凋亡率。结果:(1)香烟暴露组大鼠,体重增长速度减慢(P<0.05);不同暴露时间及暴露剂量间父代精子的数量和畸形率差异有统计学意义(P<0.05);香烟暴露组大鼠随染毒时间及剂量的增加,睾丸组织逐渐出现萎缩,曲细精管间隙逐渐变大,精原细胞细胞排列出现紊乱,甚至出现大范围无精原细胞和精子的曲细精管;雌性大鼠受孕率及子代出生数量明显减少(P<0.05);香烟暴露组父代大鼠血清中IGF-1和leptin的蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05);体重变化与IGF-1呈正相关,和Leptin呈负相关。(2)暴露组大鼠睾丸组织中SOD和GSH-Px活性均升高(P<0.05);MDA含量明显增加(P<0.05);暴露组大鼠睾丸组织中Fas、FasL、FADD、Caspase-3和Caspase-8基因在mRNA和蛋白水平上表达随着暴露时间的延长和暴露剂量的增加,均出现明显上调(P<0.05);暴露组大鼠睾丸组织中wnt-2b、β-catenin和GSK-3β基因在mRNA和蛋白表达水平上,均出现明显下调(P<0.05)。(3)暴露组子代体重的增长随着父代暴露时间的延长和暴露剂量的增加而减慢(P<0.05);雌性子代血清中IGF-1蛋白的含量在除2周高剂量组和12周低剂量组外,其他各暴露组均出现明显的降低(P<0.05);雄性子代血清中IGF-1蛋白的表达量在除8周低、高剂量组和12周低剂量组外,其他各暴露组均出现明显的降低(P<0.05)。雌性子代血清中Leptin蛋白的表达量在除2周各暴露组、6周中剂量组和8周高剂量组明显增加外(P<0.05),其他各暴露组均出现明显的降低(P<0.05);雄性子代血清中Leptin蛋白的含量在除6周中剂量组和8周高剂量组明显增加外(P<0.05),其他各暴露组均出现降低(P<0.05)。水迷宫实验中,雌性大鼠定位航行实验中潜伏期和游泳总距离变化及空间搜索实验中跨越平台次数变化均不显著;在雄性子代,则表现为潜伏期和游泳总距离总体增加的趋势,同时跨越平台次数也减少(P<0.05)。(4)雌性子代海马组织中总NOS含量除在4周中、高暴露组减少外,其他各暴露组均出现增加,且在2周和12周中剂量暴露组及6周低剂量暴露组差异有统计学意义(P<0.05);iNOS含量总体水平降低(P<0.05);NO含量在6周低、中暴露组和8周各暴露组出现明显的增高(P<0.05);BDNF蛋白含量在8周和12周各暴露组出现明显下调(P<0.05);SOD活性在各剂量暴露组均明显下调(P<0.05);GSH-Px活性在各剂量暴露组均明显增加(P<0.05);Tunel阳性细胞数在各剂量暴露组均明显增加(P<0.05);β-catenin和GSK-3β在mRNA水平上在各剂量暴露组下调明显下调(P<0.05);wnt-2b、β-catenin、GSK-3β和磷酸化GSK-3β蛋白表达量,随着暴露时间的延长和暴露剂量的增加上调(P<0.05)。雌雄子代海马组织中Caspase-3阳性细胞数在各剂量暴露组均明显增加(P<0.05)。雄性子代海马组织中总NOS及iNOS含量在各暴露组均明显的增加(P<0.05);NO含量在各暴露组均出现明显的降低(P<0.05);BDNF蛋白表达量出现明显的减少(P<0.05);SOD活性及MDA含量在各剂量暴露组明显的增加(P<0.05);GSH-Px活性只在4周低、中剂量暴露组和8周中剂量暴露组明显的降低(P<0.05);Tunel阳性细胞数明显的增加(P<0.05);wnt-2b和β-catenin在mRNA水平均表达上调(P<0.05);GSK-3β在mRNA水平表达下调(P<0.05);wnt-2b、β-catenin、磷酸化β-catenin及磷酸化GSK-3β蛋白表达量均明显上调(P<0.05);GSK-3β蛋白表达量明显下调(P<0.05)。结论:吸烟引起雄性大鼠睾丸组织结构损伤,精子生成减少,雌鼠受孕率降低,其分子生物学机制可能是吸烟使睾丸组织发生了不可逆性的损伤,损伤机制包括睾丸组织中过度的氧化应激反应,上调的死亡受体Fas/FasL凋亡信号通路和抑制的wnt/β-catenin增殖通路。父代吸烟可导致子代空间学习记忆能力受损,且对雄性子代影响更明显,引起这种表现的可能原因是父代吸烟引起了雄性子代海马组织中氧化和抗氧化系统失衡;BDNF蛋白表达下调;父代吸烟使子代海马组织中凋亡率增加,同时激活了wnt/β-catenin增殖通路,凋亡与增殖之间相抗衡使子代未出现更为明显的学习记忆损伤。