【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟相关病毒科非洲猪瘟病毒属的成员——非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）,引起的一种急性、热性、广泛出血性的高度接触传染性疾病。ASFV编码50余种结构蛋白和100多种非结构蛋白,参与病毒基因组的复制、DNA修复、转录、病毒组装及免疫逃逸等。本论文主要研究ASFV蛋白中K196R、A240L
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟相关病毒科非洲猪瘟病毒属的成员——非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）,引起的一种急性、热性、广泛出血性的高度接触传染性疾病。ASFV编码50余种结构蛋白和100多种非结构蛋白,参与病毒基因组的复制、DNA修复、转录、病毒组装及免疫逃逸等。本论文主要研究ASFV蛋白中K196R、A240L、K205R和CP312R四种蛋白。其中K196R和A240L分别是胸苷激酶蛋白和胸苷酸激酶蛋白,K205R和CP312R是两种在病毒早期表达的强免疫原性抗原蛋白。将该四种蛋白在其N端添加促溶MBP标签在原核表达系统中进行表达融合蛋白,使用TEV酶进行酶切去除促溶标签后利用亲和层析纯化目的蛋白。针对K196R和A240L蛋白在单体情况下很不稳定的情况,主要进行了提高目的蛋白稳定性的实验。例如:保留促溶标签MBP蛋白形成融合蛋白;通过生物信息技术对二级结构进行预测,根据预测结果对蛋白序列的N端或C端进行截短;与已知结构的同源蛋白氨基酸序列亲疏水性比对,进行氨基酸突变;K196R和A240L蛋白共表达;通过在溶剂中加入去垢剂、不同浓度的精氨酸等方法帮助蛋白稳定。四种蛋白中,只有K205R在去掉MBP标签后蛋白性质稳定,将K205R单体蛋白进行了商业试剂盒结晶条件液的筛选,在其中两种条件液中发现细丝状晶体,但在后续优化条件液实验中未能找到更优化的条件使晶体更大;将CP312R蛋白以MBP-CP312R融合蛋白的形式进行蛋白结晶的尝试,暂未发现有晶体出现。本实验对该四种蛋白结晶条件的初步探索对其日后的蛋白结构解析有所帮助。
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