赭曲霉毒素A(OTA)作为一种天然的污染物,存在于发霉的食物和饲料中,严重威胁到人类和动物的健康。研究表明,OTA能够引起肾毒性,肝毒性,神经毒性,免疫毒性,遗传毒性,致畸性和致癌性等多种毒性作用,其中肾毒性最为突出,影响动物和人类的健康。OTA的毒性机制主要包括氧化应激,抑制蛋白质合成,干扰免疫功能调节和能量代谢等。许多研究认为氧化应激可能是OTA诱导细胞毒性和凋亡的重要机制之一。据报道,氧化应激可通过改变基因的甲基化或乙酰化来诱导表观遗传修饰的变化。此外,毒素能够诱导表观遗传修饰的变化,有研究发现玉米赤霉烯酮通过影响表观遗传修饰而降低了卵子发育能力。然而,表观遗传是否涉及OTA诱导的PK15细胞毒性迄今尚未阐明。本研究以PK15细胞系作为体外细胞模型,旨在研究表观遗传机制在OTA诱导的细胞毒性作用中所起的作用,为OTA毒性的潜在机制提供一个新的解释。实验一:OTA诱导猪肾细胞毒性及对表观遗传相关酶的影响OTA能够通过氧化应激机制诱导PK15毒性和细胞凋亡,同时氧化应激可诱导表观遗传修饰的变化。然而,表观遗传酶修饰是否参与OTA诱导的细胞毒性和细胞凋亡尚未见报道。因此,本研究的目的是验证OTA诱导的PK15毒性和细胞凋亡,并研究表观遗传酶在OTA诱导的PK15细胞毒性和凋亡中的潜在作用。结果表明,在12小时和24小时,4μg/mL OTA能够诱导细胞毒性和细胞凋亡的产生,降低PK15细胞的活力,增加LDH释放,增加染核形态的变化,Bcl-2/Bax mRNA 比率和凋亡细胞细胞数也上升。同时,OTA处理上调了细胞的ROS水平并下调了细胞内GSH水平。另外,2.0-8.0μg/mL的OTA处理PK15细胞24小时,OTA以剂量依赖性的方式诱导细胞毒性和细胞凋亡的产生,降低了细胞活力并增加LDH释放,增加染核形态的变化和凋亡细胞数量。同时,不同的OTA浓度和不同的OTA作用时间均可以激活表观遗传学相关酶DNA甲基转移酶1(DNMT1)和组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1),使这两种酶的表达呈剂量依赖型和时间依赖型增加。同时,我们观察到高浓度的OTA增加了 DNMT1和DNMT3a表达,OTA对DNMT1表达的影响大于DNMT3a表达。总之,试验结果表明:OTA能够诱导PK15细胞的毒性并且上调及表观遗传相关酶DNMT1和HDAC1。实验二:表观遗传酶在OTA诱导的猪肾细胞毒性和SOCS3过甲基化中的作用研究实验一研究表明,OTA在诱导PK15细胞的毒性和凋亡的同时上调了DNMT1和HDAC1的表达。然而,迄今为止还没有关于表观遗传具体机制在OTA诱导的肾毒性中所起作用的报道。本研究旨在证明表观遗传相关酶在OTA诱导的肾毒性中发挥关键作用并探讨其机制。试验证明,添加DNMT1抑制剂(5-Aza-2dc)或HDAC1抑制剂(LBH589)能够分别抑制OTA诱导的DNMT1或HDAC1表达的上调。同时,添加5-Aza-2dc能够降低GSH水平并上调ROS水平。此外,抑制DNMT1后逆转了 OTA诱导的细胞活力的降低,LDH的产生以及细胞凋亡的增加。而抑制HDAC1后,细胞活力水平和GSH水平并没有显著变化,但是,细胞的LDH水平,ROS水平和细胞凋亡水平都有显著下降。总之,试验结果表明DNMT1和HDAC1在OTA诱导的细胞毒性和细胞凋亡中起关键调节作用。另一方面,OTA诱导SOCS3启动子甲基化并增加SOCS3 mRNA和蛋白水平的表达。而DNMT1抑制剂抑制SOCS3启动子甲基化并促进SOCS3表达的增加。这些结果表明,OTA通过DNMT1介导的SOCS3启动子甲基化来改变PK15细胞中的SOCS3表达,这可能使OTA是诱导PK15细胞毒性和细胞凋亡产生的一个原因,这为OTA毒性的潜在机制提供了新解释。