局灶性脑皮层发育不良（Focal cortical dysplasia,FCD）是皮质发育畸形（Malformations of cortical development,MCD）中一种常见的病理类型,MCD是难治性癫痫的重要原因,据统计,3岁以下儿童难治性癫痫中80%患儿存在MCD,而在这些患儿中有75%以上其术后病理存在FCD。1971年,Taylor等人对10例难治性癫痫患者手术切除的脑组织标本进行病理学检查,发现了异常的皮层结构,并伴有异型神经元和气球样细胞的病理现象,首次提出了“局灶性皮层发育不良”的概念,并描述了FCD的病理组织结构特点。这一概念提出后广泛应用于解剖学、病理学、神经影像学等各个专业。随着对FCD的不断认识,FCD的病理学分类标准不断更新,尤其是2004年Palmini等人提出的分类方法在临床上广泛应用,将FCD分为I型和Ⅱ型。但该分类方法的重复性一直备受争议。2011年国际抗癫痫联盟（International League Against Epilepsy,ILAE）对FCD进行了重新分类,在Palmini分类的基础上进行了修改,增加了FCDⅡ型的概念。FCDⅢ有4个亚型,FCDⅡa（FCD合并海马硬化）,FCDⅡb（FCD合并神经系统肿瘤）,FCDⅡc（FCD合并血管畸形）和FCDⅡd（FCD合并脑损伤、炎症、围产期缺氧等早期脑病变）。FCD的发病机制可能与胚胎发育早期神经元的增殖、迁移、分化等过程密切相关。人类大脑皮层形成于胚胎发育时期的第8至24周,在皮层发育中,兴奋性神经元沿着放射状方向从脑室迁移到脑皮层区域;同时,抑制性神经元沿着切线方向从神经节突起迁移到皮层。当神经元到达特定位置后,它们开始发出轴突和树突,这样就形成了神经网络。在这一时间段内任何不利因素,如感染、缺氧、外伤、基因突变等都会影响神经元的正常迁移轨迹和正常神经网络的形成。近十几年来,随着神经影像学、遗传学及高通量测序技术的不断发展及普及,FCD各亚型发病机制及致痫机制的研究越来越多。尤其是自2011年FCD新的分类标准提出以后,有关FCD型的发病机制学者们提出了很多假说,包括递质受体假说、GABA受体假说、GABA突触活动起搏器假说、mTOR通路过度激活假说、体细胞突变假说及病毒感染等。但具体的发病机制尚不明确,尤其是FCDⅡ型的发病机制,有关FCDⅡ型这一亚型发生机制的研究成为目前研究的热点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）信号通路在MCD疾病发生中的关键作用逐渐被认识,尤其是其抑制剂被批准用于结节性硬化（Tuberous Sclerosis,TSC）治疗之后。由于TSC与FCD在组织病理学、临床表现等方面高度的相似性,mTOR信号通路在FCD方面的研究也越来越多。信号转导和转录激活因子3（Signal sensor and activators of transcription 3,STAT3）是一种具有转录活性的DNA结合蛋白,可通过不同的信号通路参与生物体内细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学现象。STAT3也是mTOR通路中一个重要的下游分子。mTOR-STAT3信号通路可介导胶质细胞增生、细胞凋亡、干细胞增殖分化、自噬等过程。近些年,有研究发现STAT3与癫痫的发生关系密切,尤其是与海马神经元凋亡有关。mTOR-STAT3信号通路是否参与FCD的发病机制尚不明确,本研究拟从mTOR-STAT3信号通路探讨FCD各亚型的发病机制。STAT3与癫痫的发生有关,尤其是胶质细胞增生过程。mTOR-STAT3信号通路是否参与FCD的发生,尤其是在FCDⅡ型中的研究,尚未见报道。本研究拟从mTOR-STAT3信号通路探讨FCD各亚型的发病机制。对于FCDⅢ型,由于FCDⅢa型在手术中可以明确区分硬化的海马和周边的FCD,FCDⅢb型、Ⅲc型、Ⅲd型因原发病变肿瘤、血管病及早期脑改变与FCD界限不清,很难区分,故本研究组以FCDⅡa型为代表以研究FCDⅢ型的发病机制。精准医学的发展,使得从遗传学角度寻找FCD的候选致病基因成为当前临床研究的热点与焦点,目前报道的癫痫相关致病基因研究主要从MCD着手,至今已发现100余种与MCD相关的基因突变,但由于MCD疾病复杂且病例数量有限,FCD候选基因研究成果不多。目前,仅TSC有明确的基因突变,其他类型的MCD尚未找到确切的突变基因。因此,深入探索FCD相关的致病基因,有助于FCD发病机制及癫痫发生机制的研究。FCDⅡ型是难治性癫痫患者治疗性切除脑组织中常见的病理类型。病灶多见于颞外区域,特别是在额叶。影像学上一般表现为皮质增厚、脑沟脑回发育异常、灰白质界限不清等,尽管约60%的患儿经手术治疗后能获得良好的控制,但仍有40%的患者术后仍有反复的癫痫发作。越来越多的研究发现,FCDⅡ型存在可疑的基因突变,然而,其分子遗传学病因尚不清楚。随着精准医学的广泛推广,寻找FCD相关的致病基因成为可能。生物信息学是近年来在生命科学领域的新兴学科,随着高通量测序技术的快速发展,生物信息学分析已成为分子靶向治疗最重要的核心领域之一,也是21世纪生命科学的核心领域之一。这是一种利用计算机分析高通量测序获得的大量生物信息的科学方法。但目前国内关于FCDⅡ型的生物信息学分析尚未开展,本研究拟应用生物学信息分析的方法以期寻找FCDⅡ潜在的致病基因。第一部分FCDⅡ型基因表达的生物信息学分析目的:利用生物信息学分析的方法来寻找FCDⅡ型潜在的致病基因,从分子水平揭示FCDⅡ型的分子机制。方法:从美国国立生物数据中心GEO数据库中下载FCDⅡ型mRNA表达谱数据集GSE128300（GPL10999平台）和GSE62019（GPL10558平台）。使用R语言中Limma包鉴定FCDⅡ型与正常脑组织之间的差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）,对差异基因应用Metascape软件和David工具进行GO和KEGG功能富集分析。利用STRING数据库（https://string-db.org）在线平台,构建蛋白-蛋白互作网络PPI,利用Cytoscape程序算法从DEGs中鉴定出核心基因。然后再选取12例FCDⅡ型患儿手术脑组织标本作为实验组,以5例病理科尸检及神经外科手术颅内减压患儿作为对照组对筛选的核心基因进行体外验证。采用RT-PCR、蛋白免疫印迹和免疫组化的方法验证所筛选的核心基因在两组中的表达情况。结果:1.GEO数据库下载的FCDⅡ型mRNA两个数据集之间鉴定出167个共同的差异表达基因;2.GO和KEGG富集分析显示,差异基因主要富集在范可尼贫血通路、Hippo信号通路、髓鞘形成、细胞骨架的调控过程等生物过程,其中范可尼贫血通路富集程度最为明显;3.经Cytoscape软件分析共鉴定出5个核心基因,分别是FANCI、FANCA、BRCA2、RAD18和KEAP1;4.通过对FCDⅡ型和对照组脑组织标本进行RT-PCR检测,结果显示,筛选的五个核心基因（FANCI、FANCA、BRCA2、RAD18和KEAP1）在FCDⅡ型脑组织较正常脑组织表达明显增加（t=5.75,9.23,7.73,5.35,14.79,P均＜0.05）;5.对FCDⅡ型和对照组脑组织标本进一步进行免疫印迹结果显示,筛选的核心基因（FANCI、FANCA、BRCA2、RAD18和KEAP1）所表达的蛋白在FCDⅡ脑组织中的表达均高于正常脑组织（t=5.13,6.99,5.53,10.24,9.71,P＜0.05）;6.对两组脑组织标本进行FANCI蛋白的免疫组化结果显示,FANCI蛋白的表达在FCDⅡ型脑组织中明显增加（t=29.00,P＜0.05）。小结:1.FCDⅡ型与正常脑组织间存在差异表达基因,这些差异表达基因主要集中在范可尼贫血通路、髓鞘化过程、细胞骨架调控过程、Hippo信号通路等生物过程;2.筛选的FCDⅡ型相关的核心基因（FANCI、FANCA、BRCA2、RAD18和KEAP1）及其蛋白可能作为FCDⅡ型的分子标记物;3.FANCI、FANCA、BRCA2、RAD18和KEAP1等5个基因及其蛋白在FCDⅡ型脑组织中表达上调,可能是FCDⅡ型潜在的致病基因,为FCDⅡ型的早期诊断和治疗提供新的靶点。第二部分mTOR-STAT3信号通路在FCD亚型中的表达研究目的:检测FCD不同亚型脑组织标本中mTOR-STAT3信号通路的表达情况,探讨FCD的发病机制。方法:回顾性分析70例接受手术治疗的FCD相关的难治性癫痫患儿病历资料,筛选出病历资料完整、标本完整、诊断明确的患儿脑组织作为研究对象,其中38例纳入实验组,分别是FCDⅠ型11例、FCDⅡ型12例、FCDⅡa型15例。5例病理科尸检及神经外科手术颅内减压患者作为对照组。应用HE染色检测实验组与对照组的组织形态学表现;采用免疫组化、蛋白免疫印迹的方法检测mTOR-STAT3信号通路激活标记物:P70S6K及mTOR、STAT3、P-mTOR、P-STAT3的表达,观察mTOR-STAT3信号通路在实验组与对照组中的表达情况。结果:1.HE染色结果显示实验组中FCDⅠ型、FCDⅡ型、FCDⅡa型脑组织形态学特征符合2011年ILAE关于FCD的诊断标准;2.免疫组化结果显示P-mTOR、P-STAT3在FCDⅡ型和FCD ⅡIa型脑组织中表达较对照组明显增加（P＜0.05）,但在FCDⅠ型脑组织中表达与对照组无明显统计学差异（P＞0.05）;3.蛋白免疫印迹结果显示mTOR、STAT3在FCDⅡ型和FCD ⅡIa型中表达较对照组无明显差异,而P-mTOR、P70s6k、P-STAT3在FCDⅡ型和FCD ⅡIa型脑组织中较对照组明显增加（P＜0.05）;4.mTOR、STAT3、P-mTOR、P70s6k和P-STAT3在FCDⅠ型脑组织中较对照组相比,差异没有统计学意义（P＞0.05）;5.P-mTOR、P70s6k和P-STAT3在FCDⅡa中表达较FCDⅠ型明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;6.在FCDⅡ型和FCDⅡa型中P-mTOR与P-STAT3的表达有显著相关性,且呈正相关（R=0.614,P=0.001）;7.P-STAT3和P-mTOR在FCDⅡa海马区的表达明显高于FCDⅢa皮层区（P＜0.01）。小结:1.P-mTOR、P70s6k和P-STAT3在FCDⅡ型、FCDⅡa型脑组织表达上调,mTOR-STAT3信号通路过度激活;2.mTOR-STAT3信号通路在FCDⅠ型和FCDⅡa型中免疫活性不同,FCDⅠ型和FCDⅡa型可能存在不同的发病机制;3.mTOR-STAT3信号通路在FCDⅡa的海马区免疫活性较皮层区明显,FCDⅡa中的海马硬化病变可能是导致FCDⅡa疾病的关键。结论:1.FCDⅡ型与正常脑组织间存在差异表达基因,这些差异表达基因主要集中在范可尼贫血通路、髓鞘化过程、细胞骨架调控过程、Hippo信号通路等生物过程;2.筛选的核心基因（FANCI、FANCA、BRCA2、RAD18和KEAP1）及其蛋白可能作为FCDⅡ型的分子标记物;3.FANCI、FANCA、BRCA2、RAD18和KEAP1等5个核心基因及其蛋白在FCDⅡ型脑组织中表达上调,可能是FCDⅡ型潜在的致病基因,为FCDⅡ型的早期诊断和治疗提供新的靶点;4.mTOR-STAT3信号通路在FCDⅡ型、FCDⅢ型中过度激活,该信号通路可能参与了FCDⅡ型、FCD ⅡIa型的发病机制;5.mTOR-STAT3信号通路在FCDⅠ型和FCDⅡa型中活性不同,FCDⅠ型和FCDⅡa型可能存在不同的发病机制;6.mTOR-STAT3信号通路在FCD ⅡIa型海马区活化程度较皮层区明显,海马硬化病变可能是导致FCDⅡa疾病的关键。