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捻转血矛线虫(Haemonch us contorus)是牛、羊等反刍动物常见的胃肠道线虫,主要寄生于皱胃,以吸食宿主血液为生,给我国畜牧业发展带来巨大危害。排泄分泌抗原(escretory sectory products,ESPs)是虫体的代谢分泌产物,目前尚不清楚其对宿主免疫系统的影响。本实验室从捻转血矛线虫的ESPs中鉴定出140种与山羊外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)结合蛋白,对它们的功能进行研究,有助于阐释捻转血矛线虫与宿主之间的作用机制。本文从上述140种蛋白中选取了环化重组酶-肌动蛋白样蛋白-6(Cyclization recombination enzyme-actin like-6 protein,CREA6)、含冷休克结合域蛋白(CS domain containing protein,CS)、NADH:泛醌氧化还原酶结构域包含蛋白(NADH:ubiquinone oxidoreductase domain containing protein,NDUDC)和肝癌相关抗原 59(Hepatocellular carcinoma-associated antigen59,HCA59),对其基因进行体外克隆、表达,并初步研究了它们的重组蛋白对山羊PBMCs免疫功能的影响,为进一步理解捻转血矛线虫的排泄分泌抗原对宿主免疫系统的调节作用奠定基础。1.捻转血矛线虫4种蛋白相应基因的克隆、表达和重组蛋白的Westernblot分析本文从捻转血矛线虫的排泄分泌抗原中选取4种蛋白CREA6、CS、NDUDC和HCA59,利用RT-PCR方法对其开放阅读框进行扩增,得到大小分别为1125bp、609 bp、438 bp和426 bp的基因片段;继而成功构建原核表达质粒pET-32a-CREA6、pET-32a-CS、pET-32a-NDUDC 和 pET-32a-HCA59,经过诱导表达、纯化和复性,得到四种分子量分别为42 kD、23 kD、17 kD和16 kD的重组蛋白;以人工感染捻转血矛线虫的山羊血清作为一抗进行Western blot分析蛋白的抗原特性,结果显示4种重组蛋白CREA6、CS、NDUDC和HCA59均能被感染山羊血清所识别,表明具有良好的抗原性。2.捻转血矛线虫重组蛋白CREA6、CS、NDUDC和HCA59与山羊PBMCs的结合试验及其对细胞增殖的影响山羊颈静脉采血分离外周血单个核细胞,将其与4种重组蛋白(10 μg/mL)在体外37℃共孵育1h,利用间接免疫荧光试验检测重组蛋白与细胞的结合情况;不同浓度(0、10、20、40μg/mL)重组蛋白刺激细胞,采用CCK-8试剂盒测定其对细胞增殖的影响。结果显示,4种重组蛋白均可以在体外与山羊PBMCs结合,对细胞的增殖能力具有不同程度的提升作用。3.捻转血矛线虫重组蛋白CREA6、CS、NDUDC和HCA59对山羊PBMCs细胞因子分泌的影响颈静脉采血分离山羊外周血单个核细胞,用不同浓度(10、20、和40μg/mL)的4种重组蛋白分别刺激山羊PBMCs后,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR的方法检测细胞IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ和TGF-β的mRNA转录情况。结果显示,不同浓度的rNDUDC能引起L-4、IFN-γ的表达水平显著高于对照组(P<0.01);40 μg/mL的rHCA59引起IL-10和IL-17的表达水平较显著上升(P<0.05);20和40μg/mL的rCREA6刺激后IL-4的表达水平有显著上升,而rCS引起的细胞因子变化均不显著(P>0.05)。4.捻转血矛线虫重组蛋白CREA6、CS、NDUDC和HCA59对山羊PBMCs NO分泌和细胞迁移的影响采血分离山羊外周血单个核细胞,将不同浓度的重组蛋白分别与山羊PBMCs体外共培养,离心收集细胞上清,使用总一氧化氮检测试剂盒测定细胞中NO的分泌情况,使用迁移小室检测不同浓度的重组蛋白对细胞迁移能力的影响。结果显示,rCREA6、rCS和rNDUDC对PBMCs的NO分泌和细胞迁移均具有促进作用,且rNDUDC的刺激能力明显高于前两者;而经rHCA59刺激后,细胞的NO分泌水平有所提高,但迁移能力受到抑制,且蛋白浓度越高,抑制作用越强5.捻转血矛线虫重组蛋白CREA6、CS、NDUDC和HCA59对山羊PBMCs细胞吞噬能力的影响山羊颈静脉采血分离外周血单个核细胞,利用单核细胞贴壁生长的特点从PBMCs中分离出单核细胞,将不同浓度(10、20、40 μg/mL)的重组蛋白分别与单核细胞体外共培养,用流式细胞仪检测蛋白对单核细胞吞噬FITC-dextran能力的影响。结果显示,单核细胞经不同浓度的rNDUDC刺激后吞噬FITC-dextran能力显著提高;rCREA6在40 μg/mL时对细胞的吞噬能力有一定的提高作用;rCS刺激后细胞的吞噬能力变化不明显,而经rHCA59刺激后细胞的吞噬能力有所降低,但变化不显著。