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胞嘧啶核苷,又名胞苷,是多种抗癌药物和保健食品的重要原料。胞苷主要通过微生物发酵方法获得,但现有菌株的胞苷发酵水平不高,受到多种因素影响。为获得胞苷高产菌株,从全局代谢网络角度设计并优化胞苷代谢合成途径是有效提高胞苷合成能力的策略之一。本文主要针对胞苷降解途径、前体物PRPP代谢支路和乙酸代谢支路,提出了 3种有利于胞苷高效生物合成的策略,采用常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术改造胞苷代谢网络,构建高产菌株。主要研究内容如下:1、应用ARTP技术选育组氨酸营养缺陷型的产胞苷大肠杆菌突变株。ARTP诱变筛选技术,具有设备更精良,操作方法更简易,安全系数更高,突变频率高等优点。为了筛选高产胞苷菌株,通过ARTP技术诱变筛选组氨酸营养缺陷型突变菌,以阻断PRPP向组氨酸的代谢支路,从而提高胞苷的合成量。以大肠杆菌K-12(△thrA)为作出发菌株,使用ARTP诱变技术,在放电功率110 W,气流量10 SLPM,诱变时间为70 s的条件下,筛选得到组氨酸营养缺陷型突变菌E.coli K-12(△thrA His-)。2、应用CRISPR/Cas9系统构建cdd基因缺失大肠杆菌突变株。CRISPR/Cas9基因编辑技术近年来被用于微生物基因组改造,优化微生物基因的表达和调节,以提高化学、生物品的产量。在大肠杆菌的胞苷从头合成途径中,阻断胞苷的降解途径是胞苷大量合成的必须策略。通过敲除编码胞苷脱氨酶的cdd基因,切断胞苷的降解途径,可增加胞苷的积累。以大肠杆菌K-12(△thrA His-)为出发菌株,将CRISPR/Cas9与γ-Red系统结合,采用双质粒策略敲除出发菌株中的cdd基因。根据目的基因中设计ccd引物,将cdd基因拼接到pTargetF上,构建得到pTargetF-cdd质粒,然后,通过电转化,使质粒和同源臂结合到出发菌株的基因组上,引导Cas9蛋白识别并切割cdd基因,然后结合λ-Red重组酶,实现同源片段整合,从而使目的基因cdd被敲除,消除pTargetF和pCas质粒后,得到无抗性的突变菌株E.coli K-12(△thrA His-△cdd)。3、应用CRISPR/Cas9系统构建poxB基因缺失大肠杆菌突变株。敲除大肠杆菌中poxB基因,糖代谢产生的丙酮酸对胞苷合成是有利的。通过减弱丙酮酸向乙酸的代谢分流,为菌体生长提供更多能量,减少乙酸对大肠杆菌生长的危害,增强胞苷的从头合成的前体物质供应,从而提高胞苷合成量。以E.coli K-12(△thrA His-△cdd)作为出发菌株,应用CRISPR/Cas9结合γ-Red敲除poxB基因。根据目的基因poxB设计引物,成功构建pTargetF-poxB质粒,然后,将pTargetF-poxB电转化至含质粒pCas的大肠杆菌感受态细胞,使质粒和同源臂结合到出发菌株细胞基因组上,引导Cas9蛋白识别靶序列进行切割,并结合λ-Red重组酶,完成同源片段重组,从而敲除目的基因poxB,消除pTargetF和pCas后,得到无抗性的突变菌株 E.coli K-12(△thrA His-△cddApoxB)。4、重组菌株发酵产胞苷能力研究。将构建得到的突变菌株E.coli K-12(△thrA)、E.coli K-12(△thrA His-)、E.coli K-12(△thrA His-△cdd)和 E.coli K-12(△thrA His-△cdd△poxB)在 37℃、180 rpm条件下发酵48 h,研究发酵过程中菌体浓度、pH、葡萄糖消耗量以及胞苷产量。突变菌株E.coli K-12(△thrA His-)与对照组E.coli K-12(△thrA)相比,生长状况无明显区别,葡萄糖的消耗一直低于照组E.coli K-12(△thrA),是对照组的82.78%。E.coli K-12(△thrA)的胞苷产量为0.549± 0.015 g/L,突变菌株发酵液中的胞苷浓度为0.60± 0.011 g/L,是对照组的1.10倍。E.coli K-12(△thrA His-)的糖苷转化率提高了 30.95%。敲除cdd基因,得到的突变菌E.coli K-12(△thrA His-△cdd),生长曲线与出发菌E.coli K-12(△thrA His-)基本一致,葡萄糖消耗量略高于出发菌株,是对照组E.coli K-1 2(△thrA His-)的1.23倍。对照菌E.coli K-12(△thrA His-)的胞苷产量为 0.604±0.011 g/L,突变菌E.coli K-12(△thrA His-△cdd)的胞苷产量为 0.789±0.016 g/L,是对照组E.coli K-12(△thrA His-)的1.31倍,E.coli K-12(△thrA His-△cdd)的糖苷转化率提高了 8.18%。以E.coli K-12(△thrA His-△cdd)为出发菌株,敲除poxB基因,得到突发菌E.coli K-12(△thrA His-△cdd△poxB)。结果发现,突变菌E.coli K-12(△thrA His-△cdd△poxB)的生长速率比对照菌快,且菌体浓度也高,E.coli K-12(△thrA His-△cdd△poxB)葡萄糖的消耗量比较低,是对照组K-12(△thrA His △cdd)的88.3%。对照菌E.coli K-12(△thrA His-△cdd)的胞苷产量为 0.789± 0.016 g/L,突变菌 E.coli K-12(△thrA His-△cdd△poxB)的胞苷产量为 0.989±0.018 g/L,是对照组E.coli K-1 2(△thrA His-△cdd)的 1.25倍。E.coli K-1 2(△thrA His-△cdd△poxB)的糖苷转化率提高了 41.18%。综上所述,通过阻断PRPP向组氨酸代谢的分流、切断胞苷的降解途径以及减弱乙酸合成途径等全局代谢网络改造策略,可以有效提高大肠杆菌细胞的胞苷合成能力。