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第一部分M3 mAChR抑制对内皮细胞渗透性的影响目的：本文旨在通过观察M3型乙酰胆碱受体(Muscarinic Acetylcholine receptor M3 mAChR)阻滞对内皮细胞渗透性的影响,探讨M3 mAChR功能障碍在动脉粥样硬化发生和进展中的作用。方法：本实验采用免疫荧光组化法检测血管内皮细胞钙黏蛋白(vascular endothelial cadherin; VE-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)在EA.hy926内皮细胞上表达。通过给予M3 mAChR激动剂氯化乙酰胆碱(1×10-6M)或M3 mAChR特异性阻断剂4-DAMP(1×10-6M),采用激光共聚焦观察细胞Ca2+荧光强度的变化,验证EA.hy926内皮细胞是否有功能性M3 mAChR表达。通过给予M3 mAChR特异性阻断剂4-DAMP或应用siRNA (Small interfering RNA)技术干预M3 mAChR,采用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluorescein isothiocyanate dextran; FITC-葡聚糖)透过Transwell小室系统来评价内皮细胞渗透性的改变。MTT法检测M3 mAChR阻滞对内皮细胞活性的影响。结果：激光共聚焦下β-catenin和VE-cadherin均匀的分布于细胞边缘,表明EA.hy926内皮细胞表达VE-cadherin和β-catenin;给予M3 mAChR激动剂氯化乙酰胆碱(1×10-6M),Ca2+荧光强度增强；当用M3 mAChR特异性阻断剂4-DAMP (1×10-6M)预孵育后再给予氯化乙酰胆碱(1×10-6M),Ca2+荧光强度无变化；表明EA.hy926内皮细胞有功能性M3 mAChR表达。与对照组相比,4-DAMP和M3 mAChR siRNA能够明显增加血管内皮细胞的渗透性(*p<0.05,**p<0.01)且不伴内皮细胞活性下降(*p>0.05)结论：M3 mAChR功能障碍增加血管内皮细胞的渗透性。第二部分M3 mAChR抑制对内皮细胞黏着连接蛋白的影响目的：本文旨在通过观察M3 mAChR阻滞对内皮细胞黏着连接蛋白的影响,探讨M3 mAChR功能障碍增加内皮细胞渗透性的机制。方法：通过给予M3 mAChR特异性阻断剂4-DAMP或应用M3 mAChR siRNA技术,采用免疫印迹法测定黏着连接蛋白VE-cadherin和β-catenin的表达；采用免疫共沉淀和免疫印迹法测定黏着连接蛋白VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；采用免疫印迹法测定Triton 100-X不溶部分中VE-cadherin和β-catenin的变化,观察M3 mAChR抑制对黏着连接蛋白复合体与细胞骨架肌动蛋白之间连接的影响。采用免疫荧光组化法检测VE-cadherin和β-catenin在细胞边缘的分布情况。结果：M3 mAChR特异性阻断剂4-DAMP (1×10-6 M; 0,15,30 min)和M3 mAChR siRNA显著地增加VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平(*p<0.05)；降低经Triton 100-X不溶部分(与细胞骨架相连蛋白)中VE-cadherin和β-catenin的表达(*p<0.05)；但对VE-cadherin和β-catenin的表达无影响(*p>0.05)。4-DAMP (1×10-6 M；45 min)显著下调VE-cadherin和β-catenin在细胞边缘和细胞-细胞连接处的表达。结论：M3 mAChR抑制通过促进黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化,下调其在细胞边缘和细胞-细胞连接处的表达,同时减弱黏着连接蛋白复合体与细胞骨架肌动蛋白之间连接,从而使内皮细胞渗透性升高。第三部分M3 mAChR抑制通过降低PTP1B活性介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化目的：本文旨在通过观察蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B,PTP1B)对M3 mAChR抑制介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化的影响,探讨其中的相关机制。方法：通过给予M3 mAChR特异性阻断剂4-DAMP阳应用PTP1B siRNA技术,采用免疫共沉淀和免疫印迹法测定黏着连接蛋白VE-cadherin和β-catenin的酪氨酸磷酸化水平；PTP1B检测试剂盒测定PTP1B活性变化。给予cAMP的类似物8-Br-cAMP(1×10-5M)或PKCα的活化剂PMA (1×10-7M),研究M3 mAChR抑制对PTP1B活性下调的可能信号机制。结果：PTP1B特异性siRNA显著增加VE-cadherin和P-catenin的酪氨酸磷酸化水平(**p<0.05)。同时进一步促进4-DAMP介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化(#p<0.05)。4-DAMP降低PTP1B的活性(*p<0.05),但对其表达无影响(*p>0.05)。8-Br-cAMP (1×10-5M; 10min)对PTP1B活性无影响,但显着地抑制4-DAMP对PTP1B活性的下调作用(#p<0.05)；但是,PMA (1×10-7M; 10min)对4-DAMP介导PTP1B活性下调无影响(#p>0.05)。结论：M3 mAChR抑制通过降低PTP1B的活性从而介导黏着连接蛋白酪氨酸磷酸化水平升高。M3 mAChR抑制介导PTP1B活性下调主要是通过信号分子cAMP而非PKCα。第四部分IQGAP1参与M3 mAChR抑制下调Rac1活性介导黏着连接复合体与细胞骨架蛋白分离目的：本文旨在通过观察M3 mAChR抑制对Rac1活性的影响。探讨M3 mAChR抑制减弱黏着连接复合体与细胞骨架蛋白之间连接的相关机制。方法：本实验通过给予M3 mAChR特异性阻断剂4-DAMP和应用IQGAP1 siRNA技术,采用免疫印迹法测定Triton 100-X不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达的变化,观察IQGAP1对M3 mAChR抑制介导黏着连接蛋白复合体与细胞骨架肌动蛋白分离的影响。采用pull-down法检测M3 mAChR抑制对Racl舌性的影响。采用免疫共沉淀和免疫印迹法测定M3 mAChR抑制对IQGAP1-Rac1蛋白复合体与IQGAP1-β-catenin蛋白复合体表达水平的影响。为研究NO是否参与M3 mAChR抑制介导的黏着连接复合体与细胞骨架蛋白之间分离,给予NO供体SNAP预处理,用免疫印迹测定Triton 100-X不溶部分中VE-cadherin和β-catenin的变化,用pull-down法测定其对Rac1活性的影响。结果：IQGAP1特异性siRNA减少Triton 100-X不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达(**p<0.05)；同时进一步促进4-DAMP介导的Triton 100-X不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达减少(#p<0.05)；这些结果表明,(?)QGAP1维持黏着连接复合体与细胞骨架蛋白之间的连接并且参与到M3 mAchR抑制介导它们之间的分离。4-DAMP ( 1×10-6M; 0,5,10,15min)降低Rac1活性(*p<0.05),而对Rac1蛋白表达无影响(*p> 0.05)。4-DAMP (1×10-6M)降低Rac1-IQGAP1复合体的水平,却增加IQGAP-β-catenin复合体的水平(*p<0.05)；给予M3 mAChR激动剂,氯化乙酰胆碱(1×10-8摩尔/升)预处理,显著抑制4-DAMP介导Rac1-IQGAP1复合体与IQGAP-β-catenin复合体的变化(#p<0.05)；这些结果表明抑制M3 mAChR降低Rac1活性使IQGAP1与Rac1分离并通过与β-catenin相结合从而使VE-cadherin/β-catenin复合体与细胞骨架肌动蛋白分离。NO供体SNAP显著抑制4-DAMP介导的Rac1活性下调和Triton 100-X不溶部分中VE-cadherin和β-catenin表达减少(**p<0.05),但与无干预组相比均仍有下降(#p<0.05)；表明M3 mAchR功能障碍引起NO减少导致VE-cadherin/β-catenin复合体与细胞骨架肌动蛋白之间的分离以及Rac1活性的下降,并且这一过程存在NO非依赖性途径。结论：M3 mAChR抑制降低Rac1活性,使IQGAP1与Rac1分离并通过与β-catenin相结合从而使VE-cadherin/β-catenin复合体与细胞骨架肌动蛋白分离。