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背景白细胞介素-35(Interleukin-35,IL-35)是白细胞介素12细胞因子家族的新成员,由EBI3亚基和P35亚基构成。本课题组前期研究发现IL-35在胰腺癌细胞中高表达,且与患者的不良预后相关。一方面,肿瘤源性IL-35通过上调ICAM1的表达促进肿瘤细胞出血管和远处转移过程;另一方面,肿瘤源性IL-35通过上调CCL5招募单核细胞,并促进单核细胞分泌CXCL1和CXCL8,进而促进血管新生和肿瘤生长。目前关于IL-35的研究主要集中于某些炎性疾病,自身免疫性疾病,感染性疾病以及某些肿瘤中。然而至今尚无关于肿瘤源性IL-35与胰腺癌化疗效果的相关研究。本课题前期研究发现肿瘤源性IL-35的高表达与患者无进展生存期及吉西他滨单药化疗效果呈负相关。因此我们设计本课题,从临床水平、细胞水平及动物实验水平进一步明确肿瘤源性IL-35在胰腺癌化疗中的作用及其调控机制,并进一步探索肿瘤源性IL-35是否能够成为指导胰腺癌化疗方案选择的生物标志物。方法1.收集接受吉西他滨单药化疗的胰腺癌手术石蜡标本及胰腺癌肝转移穿刺标本,进行IL-35两个亚基EBI3和p35的连续切片共定位免疫组化染色,对收集的病例资料进行预后随访,通过Kaplan-Meier生存曲线及卡方检验分析IL-35的表达水平与患者无复发生存期及吉西他滨单药化疗效果之间的关系。2.构建并验证人胰腺癌细胞降表达/过表达IL-35的稳定转染细胞系,体外采用流式细胞术、CCK8等实验检测不同IL-35表达水平的肿瘤细胞在吉西他滨杀伤下的细胞活力和凋亡率;体内构建SCID免疫缺陷鼠皮下成瘤模型,经腹腔给予吉西他滨单药化疗药,观察不同IL-35表达水平对移植瘤的生长曲线、小鼠的生存期以及肿瘤组织内细胞凋亡率的影响。通过体内、体外实验探索IL-35是否影响吉西他滨对胰腺癌细胞的化疗敏感性。3.通过DHE染色、JC-1染色分别检测吉西他滨刺激后不同IL-35表达水平的胰腺癌细胞活性氧类(Reactive oxygen species,ROS)水平及细胞膜电位水平,采用Western blot检测Caspase3、BAX、BCL-2等ROS相关凋亡信号通路激活情况。通过ROS清除实验及ROS诱导实验明确ROS在IL-35介导的化疗耐药中的作用。4.通过转录组测序筛选IL-35下游影响ROS代谢的靶标SOD2;Western blot及RT-PCR验证测序结果;采用Western blot、RT-PCR、CHIP及双荧光素酶实验明确IL-35调控SOD2的分子机制。进一步通过阻断试验确定SOD2在IL-35介导的化疗耐药中的作用。5.通过RT-PCR、Western-blot、ELISA检测等方法检测吉西他滨处理后胰腺癌细胞IL-35表达水平的变化。通过生物信息学分析筛选能够影响IL-35表达的信号通路,采用染色质免疫共沉淀以及双荧光素酶实验探索吉西他滨上调IL-35的分子机制。6.通过小鼠皮下成瘤模型初步探索IL-35中和抗体在胰腺癌化疗增敏中的作用。结果1.通过对接受吉西他滨单药化疗的92例胰腺癌组织标本及49例胰腺癌肝转移穿刺标本进行免疫组化染色发现,IL-35高表达患者的无复发生存期明显低于低表达患者(中位生存期:375.0 vs 456.7天);同时,IL-35高表达患者吉西他滨的化疗效果较差。2.体外吉西他滨杀伤实验证实,过表达IL-35导致胰腺癌细胞对吉西他滨敏感性降低,而降表达IL-35导致胰腺癌对吉西他滨敏感性升高。体内实验中,过表达IL-35导致肿瘤体积较大,小鼠生存期缩短,细胞凋亡率降低;而降表达IL-35具有相反的结果。3.体外实验中发现IL-35过表达可以显著地降低吉西他滨诱导的活性氧水平,而IL-35降表达则显著地升高吉西他滨诱导的活性氧水平。体外的回复实验及阻断实验证实IL-35正是通过降低细胞活性氧水平来降低吉西他滨杀的杀伤作用。4.转录组测序发现IL-35过表达后超氧化物气化酶2(Superoxide Dismutase2,SOD2)表达水平明显上调,RT-PCR、Western blot实验验证了IL-35对SOD2的调控作用;阻断试验发现,当过表达IL-35细胞下调SOD2表达后,该细胞系对吉西他滨敏感性不再有明显的升高。机制上,IL-35通过受体gp130同源二聚体激活STAT1磷酸化,p-STAT1同源二聚体入核后激活SOD2的表达。5.吉西他滨处理后肿瘤细胞IL-35蛋白水平以及mRNA水平表达明显升高。机制上,吉西他滨能够激活NFκB信号通路,通过ChIP实验以及双荧光素酶实验证实NFκB p65能够直接结合在EBI3及P35的启动子区并增强其转录活性。6.在鼠源Pan 02细胞皮下成瘤模型中,IL-35中和抗体能够显著增强吉西他滨单药化疗效果,表现为小鼠生存期的延长及瘤负荷的减低,肿瘤组织中细胞凋亡率增加,ROS水平降低。结论1.胰腺癌组织中IL-35高表达患者的无复发生存期较差。胰腺癌肝转移穿刺标本中IL-35高表达患者的吉西他滨单药化疗效果较差。2.IL-35通过受体gp130激活JAK-STAT信号通路,p-STAT1同源二聚体入核,促进SOD2的表达,进一步降低细胞活性氧水平从而降低吉西他滨的杀伤作用。3.吉西他滨通过激活NFκB信号通路促进IL-35两个亚基的转录,进而促进IL35的表达,进一步的促进了胰腺癌细胞的ROS清除能力,强化癌细胞的耐药能力。4.IL-35中和抗体能够增强吉西他滨的杀伤作用,因此IL-35有望成为胰腺癌治疗的潜在靶点。