猪脑中神经节苷脂提取物的分离纯化及其抗焦虑作用研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:TIMLEE123
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焦虑症已经成为一种高发病率、高致残率和低治愈率的全球流行性精神疾病,特别是随着如今生活节奏的加快和社会压力的剧增,由焦虑症导致的社会负面影响也就愈演愈烈。而现有治疗药物由于具有不能彻底治愈焦虑症、有中枢镇静性不良反应和起效慢等缺陷,并不能满足焦虑症的防治要求。神经节苷脂类物质具有抗神经毒性、神经保护和类脑源性神经营养因子(BDNF)作用。但目前针对神经节苷脂提取物(GGE)及其神经节苷脂单体的抗焦虑作用未见有系统研究。本文旨在系统研究GGE对焦虑模型小鼠的抗焦虑作用,并对GGE进行分离纯化,得到神经节苷脂单体,并进一步研究神经节苷脂单体对焦虑模型小鼠的抗焦虑作用及其作用机制。具体研究方法与结果如下:(1)以冰冻猪脑为原材料制备了GGE;并利用高架十字迷宫实验(EPM)和明暗箱实验(LDB)评估GGE在50 mg/kg、100 mg/kg和200 mg/kg给药剂量下的抗焦虑作用。12.09 kg冰冻猪脑经两次提取、萃取、沉淀、浓缩、透析和冻干之后,得到浅黄色粉末的GGE约47.57 g,提取得率为0.39%。EPM实验结果显示,与空白对照组比较,高剂量的GGE可以显著增加小鼠进入开放壁次数百分比(OE%),中高剂量的GGE可以有效提升小鼠在开放壁时间百分比(OT%);LDB实验结果显示,与空白对照组比较,中高剂量的GGE和地西泮(DZP)都可以显著延长小鼠在明箱的时间,且GGE在发挥延长小鼠在明箱时间的作用具有一定的剂量依赖关系。(2)联用使用多种分离纯化手段对GGE进行纯化,得到较高纯度的神经节苷脂单体,利用高分辨质谱和液相色谱(HPLC)进行鉴定,并通过高效液相色谱法对纯化得到的神经节苷脂单体进行含量测定。GGE在DEAE-Sephadex A-25离子交换层析上分别以0.05 M乙酸钠甲醇溶液和0.2M乙酸钠甲醇溶液洗脱,得到单唾液酸神经节苷脂组分和多唾液酸神经节苷脂组分。分别以Sephadex G-10凝胶层析和硅胶层析之后,得到两个纯度较高的神经节苷脂单体物质。经高分辨质谱和HPLC色谱鉴定,确定从GGE中纯化得到的两个物质分别为GD1a和GM1。经建立的HPLC含量测定方法检测,确定其纯度分别为86.55%和94.32%。(3)利用EPM和LDB初步评估GD1a和GM1在10 mg/kg和50 mg/kg给药剂量下对小鼠的抗焦虑作用,利用旷场实验(OFT)初步评估GD1a和GM1对小鼠自主活动的影响。EPM实验结果显示,与空白对照组比较,GD1a高剂量组显著提高小鼠的OE%水平;GD1a低高剂量组、GM1高剂量组和DZP组均可以显著提高小鼠的OT%;LDB实验结果显示,与空白对照组比较,高剂量的GD1a可有效增加小鼠进入明箱的次数以及在明箱的时间。OFT实验结果显示,在10-50 mg/kg剂量范围内,GD1a和GM1均对小鼠自主活动无显著影响。(4)基于DA能系统、Glu能系统和γ-GABA能系统,利用HPLC-UV和OPA柱前衍生化-HPLC-UV,分别测定GD1a和GM1对小鼠脑组织中DA、Glu和γ-GABA含量变化的影响。测定小鼠脑组织内DA含量变化的结果显示,GD1a和GM1均在不同程度上增加小鼠脑组织的DA含量,其中,GD1a高剂量组和GM1高剂量组较空白对照组显著增加小鼠脑组织中的DA含量。测定小鼠脑组织内Glu和γ-GABA含量变化的结果显示,GD1a高剂量组较空白对照组显著降低小鼠脑组织中的Glu含量。综上所述,本文揭示了GGE可以有效降低EPM和LDB实验小鼠的焦虑行为;GGE经分离纯化得到GD1a和GM1,并以EPM和LDB确定了GD1a和GM1在50 mg/kg的剂量下具有一定的抗焦虑作用,且GD1a和GM1在10-50 mg/kg剂量范围之内对小鼠的自主活动无明显影响。通过HPLC测定GD1a和GM1对小鼠脑组织中DA、Glu和γ-GABA含量变化情况,发现GD1a和GM1或许是通过影响DA的含量来发挥抗焦虑作用的,而GD1a的抗焦虑作用还与降低小鼠脑组织中Glu含量有关,这可能是GD1a活性略高于GM1的重要原因。
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