金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是医院和社区获得性感染中最常见的病原体。该菌可引起多处感染,如皮肤浅表、深部皮肤、伤口败血症、肺炎、感染性关节炎、中毒性休克综合征、心内膜炎、骨髓炎等。经抗菌药物治疗后,发病率和死亡率仍然很高。在金黄色葡萄球菌引起的感染中,心内膜炎是死亡率最高的,从20%到40%不等。因此金黄色葡萄球菌引起的细菌感染已成为不容忽视的问题。生物膜是微生物在自然界中的生存方式,其具有超强的耐药性,从而导致了金黄色葡萄球菌感染的顽固性和难治性。1994年,BIGGER发现具有表型抗性但遗传易感的细菌亚群“持留菌”,它们生长缓慢,在生物膜成熟过程中形成,对抗菌药物有耐受性。持留菌的存在可能是其临床治疗失败和复发感染的主要原因,因此,本课题通过探究ε-多聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌持留菌的基本特征和形成机制,为其它种类中持留菌的研发提供理论依据。目的1.了解ε-多聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌持留菌的抑菌活性以及对生物膜的影响,并进一步探究ε-多聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌持留菌的抑菌机制。2.动态监测金黄色葡萄球菌持留菌在生物膜形成过程中,尤其是在粘附阶段中的形成情况,以进一步阐释持留菌形成与早期生物膜以及与粘附阶段可能的关系。3.以粘附阶段的早期生物膜为研究对象,通过对生物膜细胞群进行原核转录组测序技术分析基因表达变化,初步筛选出与持留菌形成相关的可疑基因,从而为进一步探索金黄色葡萄球菌持留菌形成相关信号传导途径的具体机制提供基础,为研究新型抗菌药物提供新的靶点,为临床治疗顽固性复发性细菌感染、清除持留菌提供新的思路。方法金黄色葡萄球菌生物膜持留菌是在用高浓度ε-多聚赖氨酸冲击金黄色葡萄球菌生物膜后出现的杀菌曲线。从持留菌被发现后,剂量依赖性杀灭曲线就是持留菌分离研究的最有效的办法。本实验中我们采用微量比浊法的方法通过ε-多聚赖氨酸(10MIC)来确定金黄色葡萄球菌生物膜持留菌,MIC利用了团队中前期研究的结果。首先用金黄色葡萄球菌USA300预先覆盖96-孔细胞培养板的表面24h形成早期生物膜,并在显微镜下观察确认附着表面被完全覆盖,并动态监测在生物形成过程中持留菌的产生。持留菌的确定基于ε-多聚赖氨酸作用后对细胞活力的评估。此外,我们还在加入ε-多聚赖氨酸处理生物膜的同时通过刮擦破坏附着的情况下,监测了生物膜中持留菌细胞水平。荧光分光光度计测定ε-多聚赖氨酸处理前后金黄色葡萄球菌菌体内ROS活性氧含量;ELISA测定饥饿状态对金黄色葡萄球菌生物膜持留菌形成的影响;飞行质谱仪检测ε-多聚赖氨酸处理前后金黄色葡萄球菌前后蛋白谱的变化。原核转录组测序筛选差异表达基因,获取相关代谢通路。结果1.ε-PL作用S.aureus后筛选持留菌最佳药物浓度为312.5mg/mL。2.ε-PL作用S.aureus后存在持留菌。3.金黄色葡萄球菌生物膜持留菌的形成与生物膜的成熟程度有显著关联。营养状态对金黄色葡萄球菌生物膜持留菌的产生有影响,饥饿状态能提高持留菌的产生比列,揭示了金黄色葡萄球菌持留菌的形成与能量有关。4.原核转录组测序分析检测出金黄色葡萄球菌生物膜持留菌中tpiA,glpK,UreG,pgi,clpP,eno的表达水平有显著性差异(P<0.05),不仅仅由单一的信号通路决定,受诸多复杂的信号途径调控。结论1.金黄色葡萄球菌持留菌的形成与其生物膜形成密切相关。2.原核转录组是快速筛选差异表达基因最有效的方法,我们获得的数据为后续研究持留菌产生机制及基因的通路功能奠定了基础。金黄色葡萄球菌生物膜持留菌的形成与基因tpiA、pgi以及eno密切相关。