研究背景肾移植作为终末期肾病的最佳替代治疗选择在全世界广泛的开展,我国是仅次于美国的第二大移植大国。至2002年底,全世界纳入统计的肾移植数量超过55万例次,亲属肾移植存活时间最长者达39年,尸体肾移植达30年。随着配型技术的提高和新型免疫抑制剂不断应用于临床,肾移植的近期效果明显提高,移植肾半数生存时间由原来的6.7年提高到10.9年。但据统计过去10年移植肾长期存活却没有明显改善。而几乎所有移植肾都存在慢性间质纤维化的过程,35～40%的移植肾失功是由于间质纤维化直接导致。因此研究如何诊断和防治移植肾间质纤维化,延长移植肾的长期生存寿命,成为亟待解决的问题。移植肾间质纤维化(renal allograft interstitial fibrosis, RAIF)是损伤因素和修复因素不断作用的结果,其实质是胶原纤维在肾间质堆积和改造的过程。目前实验研究表明众多细胞因子与纤维化关系密切。TGF-β在肾间质纤维化过程中起着关键的作用；AT-Ⅱ能够促进成纤维细胞的增生,抑制其凋亡,促进肾间质纤维化发生；尚有包括ET-1、IL-1、PDGF、TNF-α等因子参与肾脏纤维化的过程。这些血清学指标虽可以间接反应肾间质纤维化的程度,但无特异性。而目前“金标准”肾组织活检是基于胶原纤维特殊性染色和病理医生的人为评估,客观性和重复性差,对肾间质纤维化的评估比较粗略,无法进行精确的定量分析。非线性光学成像技术为研究组织内胶原纤维提供了一种新的方法。在非线性光学成像技术中,二次谐波(second harmonic generation, SHG)最适合对组织非中心对称性分子进行成像,SHG信号强弱与生物组织中的胶原含量密切相关,能特异性显示纤维性胶原沉积情况及三维形态。双光子激发荧光(two-photon excited fluorescence, TPEF)是另外一种光学现象,标本无需荧光染色,直接获取组织内的天然荧光信号来显示组织细胞等结构。两种成像装置兼容,复合成像可以互为印证和补充,直接展现组织形态。目前已用于包括角膜、鼠尾肌腱、人的皮肤及疤痕组织、小鼠的肾脏、大鼠的肝脏、人的肝脏等胶原纤维的成像,以及用于鼻咽癌、肾癌、肝癌等肿瘤判断良恶性、是否复发等多个生物医学领域。与传统病理染色技术相比,非线性光学成像技术有以下优势：①SHG能够区分纤维胶原和非纤维胶原蛋白,对病理性胶原纤维堆积具有特异性,可以定量测定。②组织标本无需染色,可以排除染料成分、染色步骤或褪色等原因产生的染色差异：可以避免受到使用荧光剂所带来的浓度和光漂白效应的影响。③可以显示纤维胶原三维结构。④TPEF可以补充结构和细胞成分信息。目的1.收集病理资料,掌握我科移植肾活检病理的相关数据资料,为下一步实验选择病例及准备标本。2.了解非线性光学成像技术对移植肾间质纤维化的成像效果,并与传统病理方法对比来验证其优势。3.探索使用非线性光学成像技术进行移植肾间质纤维化的定量方法。方法1.病理资料的收集a).研究对象研究对象为2005-2011年之间在我科行移植肾活检术并且可以查找到完整病理资料及相关临床资料的患者,共有663例次。包括尸体肾移植,亲属活体肾移植及临床心脏死亡捐献的肾移植受者的肾活检资料。b).研究内容资料收集的内容包括：患者的基本信息；移植肾穿刺活检的指征分布；病理结果的分布：特殊病理结果的分析及相关临床资料等。c).研究方法所有收集的病理标本均在我院病理科获得,病理切片常规进行HE、Masson、PAS染色。所有病理报告都是由病理科医师依照Banff05和Banff07的标准进行病理诊断及分级。2.非线性光学成像技术在移植肾间质纤维化诊断中的应用a).病例收集从上面收集的663例次的肾活检病理资料中选出40例患者的40次病理活检资料,轻度纤维化22例,中重度纤维化18例,收集其病理资料及相关临床资料。收集了2只正常wistar大鼠右侧肾脏组织。b).标本准备在我院病理科获取40例患者移植肾活检组织的石蜡标本,并将2只大鼠右肾组织标本进行石蜡包埋。病理切片厚度为4μm,连续切2张病理切片,分别标记为1、2,将标本脱蜡晾干,第1张行HE染色。第2张切片脱蜡晾干后无需做任何处理,直接使用非线性光学设备获取SHG/TPEF图片,再将第2张切片行Masson染色。以比较同一切片相同部位2种方法对间质纤维化的成像情况,减少误差。c).实验方法所有的传统病理染色方法均在我院病理科完成,均按照传统的HE、Masson染色方法进行。非线性光学成像技术的方法包括：登陆Genesis操作软件系统→按界面指示载入病理切片标本→设置扫描参数→选定扫描区域→开始扫描图片→将所扫描的图片按照扫描的先后秩序进行拼合,图片存为“tif”格式。其中人移植肾穿刺标本沿标本长轴将整个标本全部扫描完成。大鼠肾脏标本按照皮质5个区域、髓质3个区域、集合系统1个区域进行扫描,每个区域大小按照5×5张(每张图片分辨率为512×512pixel,放大倍数为20倍)。3.探索使用SHG/TPEF图像进行移植肾间质纤维化的定量分析方法a).研究对象：实验中同一张切片所取得的SHG/TPEF图像和Masson图像,共采集了20张标本图像。b).研究内容：使用Image-Pro-Plus6.0(IPP)图像处理软件对实验中取得的SHG/TPEF图像及Masson图像进行分析,定量分析移植肾间质纤维化。c).研究方法使用IPP软件的图像计算功能对SHG/TPEF图像及Masson图像中纤维化面积占整张图片的面积百分比进行计算。主要步骤包括：进入软件界面→打开分析图片→设置计算参数→选定纤维化范围→计算并输出结果。4.统计方法计量资料的描述以均数±标准差(X±SD)来表示,两组患者的基本资料采用两独立样本的t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。使用SPSS17.0统计软件对SHG/TPEF图片定量法和Masson图片定量法得出的分级结果进行平行效度检验,得出的kappa值>0.75表示一致性好,0.40≤kappa值≤0.75表示一致性较好,kappa值<0.4表示一致性差。结果1.我科2005-2011年期间移植肾活检病理资料及相关临床资料分析移植肾活检最主要的指征是不明原因的血肌酐升高,占全部指征的74.36%,第二位的活检指征是蛋白尿／血尿。移植肾病理结果显示排斥反应占59.28%,其中急性排斥反应204例次(30.77%),慢性排斥反应189例次(28.51%)。分析近几年数据发现我科急性排斥的发生率呈下降趋势。病理结果中还发现新发／复发性肾病9例,乙肝相关性肾病9例。整理了15例部分程序性肾活检病例,发现其中5例出现早期的肾脏病变,其中1例诊断为IgA肾病,另有2例发现了轻度的肾小管萎缩肾间质纤维化,2例诊断为隐匿性排斥反应。2.非线性光学成像技术在移植肾间质纤维化诊断中的应用获得的SHG/TPEF图像由SHG信号和TPEF信号相互叠加而成。其中SHG图像呈绿色信号,代表胶原纤维组织；TPEF图像呈红色信号,代表肾组织图像。大鼠肾脏和人移植肾活检组织标本的SHG/TPEF图像都可以清晰的分辨出肾小球、肾小管、肾血管等肾组织的镜下结构,可以观察到肾间质和肾小球、肾小管及肾血管周围分布的呈绿色信号的胶原组织沉积。SHG/TPEF图像既能够清晰显示肾脏胶原纤维及肾组织结构,又可以呈现纤维胶原在肾脏中沉积的部位。与传统的Masson染比较,SHG/TPEF图像也可以清晰的显示肾组织的基本结构。对于轻度移植肾间质纤维化的标本,SHG/TPEF图像可以清晰的显示在肾小球周围、肾小血管周围、肾小管周围及肾间质内少量散在的呈绿色信号的胶原纤维沉积,而Masson染色基本正常,未发现轻度的纤维化表现。对于中重度移植肾间质纤维化的标本,SHG/TPEF图像显示与Masson染色基本相同,但可以更直观更容易的观察到呈绿色信号的纤维胶原分布的范围及沉积的部位。3.移植肾间质纤维化的定量方法：由于SHG/TPEF图像只有红色和绿色两种颜色组成,使用IPP软件可以很轻松的对SHG/TPEF图像上呈绿色的纤维胶原面积百分比进行定量计算。根据计算结果得出的Banff分级与临床病理报告分级基本吻合。同时将SHG/TPEF图像定量法与Masson图像定量法得出的结果进行平行效度检验,得出kappa值为0.835,表示两种方法的结果一致性好。结论1.移植肾活检是确诊移植肾病变的重要方法,程序性活检还可以及时发现早期隐匿性的移植肾病变。移植肾活检在协助临床明确疾病诊断,指导临床治疗方面起着至关重要的作用,对提高移植肾远期存活时间意义重大。2.非线性光学成像技术能够清晰的显示肾间质纤维化及肾组织结构。与传统的病理方法相比,非线性光学成像技术所需的病理标本不需要做任何染色,所得的SHG/TPEF图像能够更直观、更早期的发现移植肾间质纤维化。3.初步研究提示使用SHG/TPEF图片进行纤维化定量及分级与传统病理方法具有良好的一致性,是一种新的有极大研究潜力的移植肾间质纤维化的定量方法。