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microRNA是一类长度22个碱基左右的非编码小RNA分子,通过与靶mRNA结合使其降解,在转录后水平调控基因表达以实现其负调控功能。氧化铁磁性纳米粒子作为磁共振成像造影剂,在生物医学研究领域有着广泛应用。然而,细胞如何输运氧化铁纳米粒子,它在生物体内究竟会发生什么变化,产生何种生物效应,这一系列问题都未能得到详细阐述。本文首次引入了miRNA表达谱实验手段来研究一种纳米材料与生物的相互作用过程,并通过生物信息学方法来系统分析氧化铁纳米粒子与PC12细胞相互作用的生物过程。论文主要工作如下:
1.通过显微镜形态观察和MTT检测细胞活力,验证了氧化铁纳米粒子较好的生物相容性,确定了后续实验所用的粒子浓度。使用普鲁士蓝染色法观察了不同时间点氧化铁磁性纳米粒子进入PC12细胞的情况,确定了表达谱制样共培养的时间长度。
2.使用氧化铁纳米粒子作用PC12细胞并提取miRNA,预PCR,经琼脂糖凝胶电泳检测质量合格后,送至公司进行SOLiD高通量测序。获得测序结果miRNA表达谱数据后,采用了实时荧光定量PCR的方法对筛选的8个miRNA的表达水平进行了验证,确保miRNA表达谱数据真实可靠。
3.引入Z值检验统计方法来筛选差异表达显著的miRNA。通过Cluster和Treeview软件对相对表达数据做平均连锁层次聚类。将miRNA分组并对各组miRNA进行靶序列的生物信息学预测。
4.引入费歇尔恰当概率检验方法,使用DAVID软件对预测得到的靶序列做基因本体论注释以及信号途径功能分析。系统研究了氧化铁纳米粒子作用PC12细胞这一生物学过程中涉及的各类生物过程及分子功能和相关信号通路。给出了单个miRNA在某一生物过程中功能分析的方法。