系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种累及多器官、多系统的、临床表现多样的慢性自身免疫性疾病。目前,较为公认的SLE发病学说是：在遗传及环境因素共同作用下,SLE患者自身抗原介导的免疫耐受被打破,导致T、B淋巴细胞异常活化,炎性因子、自身抗体过量产生在SLE的发生发展中发挥重要作用。目前,SLE的治疗主要依赖于糖皮质激素和细胞毒药物(如环磷酰胺),新的免疫抑制剂如霉酚酸酯、抗CD20单克隆抗体等药物治疗SLE也有一定疗效,但重症、难治性SLE患者1年和5年死亡率仍高达20%和35%左右。许多学者认为系统性红斑狼疮(SLE)是一种干细胞疾病,不仅造血干细胞存在异常,骨髓间充质干细胞(BMSCs)也存在异常。近年来同种异体BMSCs移植治疗顽固性难治性SLE取得了很大进展2003年Lkehara等率先报告了用异基因造血干细胞和骨髓间充质干细胞共移植治疗狼疮鼠后,其生存期超过两年。随后,有报道发现正常人BM-MSCs及脐带血MSCs能有效治疗狼疮鼠的狼疮性肾炎,且脐带MSCs移植后可以降低抗-dsDNA抗体水平、减少24h尿蛋白量、减轻狼疮肾病理及肺部炎症浸润程度,对MRL/lpr小鼠的LN、间质性肺炎有较好的疗效。2009年Sun等报道了同种异体间充质干细胞(MSCs)移植治疗4例环磷酰胺或糖皮质激素抵抗的难治性SLE,其疗效肯定且无移植相关并发症发生。但2010年Carrion等报道自体BMSCs移植治疗2例SLE效果却不理想。这提示SLE患者的BMSCs可能存在某些缺陷。间充质干细胞(MSCs)是一类中胚层来源的非造血干细胞,是造血微环境的重要成分,具有高度自我更新、体外高度扩增、多向分化、支持造血、免疫调节及诱导免疫耐受能力、免疫原性弱、组织修复再造等特点。近年来,MSCs的衰老及其免疫功能紊乱日益受到关注。细胞衰老是一种由DNA损伤、氧化应激、基因表达失衡和其他细胞有害刺激所致的不可逆的生长停滞。衰老的MSCs具有一般细胞衰老时的特征：1)细胞增殖缓慢、细胞集落数下降及不可逆G1期生长停滞；2)多向分化潜能显著降低；3)端粒缩短、端粒酶活性抑制；4)衰老相关p-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性增加；5)细胞体积增大、肌动蛋白应力纤维重排、超微结构改变；6)包括转化生长因子β(TGF-β)、骨形成蛋白-2/4、IL-6在内的多种细胞因子分泌异常；7)调节细胞生物学行为(如细胞周期、DNA损伤后修复及有丝分裂等)相关基因的表达变化。目前,细胞衰老调节机制有许多假说,其中细胞周期的失调控被认为在细胞衰老中具有关键作用。已有研究证明,细胞衰老的调节机制主要包括p53/p21CiP1、p16INK4a/Rb、p27KiP1/pTEN等调节机制。基于此,本研究拟从SLE患者BMSC异常的生物学行为及其细胞周期调控蛋白P27kip1/PTEN表达进行分析；旨在证实SLE患者BMSCs可能是衰老的干细胞及分析可能的衰老机制。第一章SLE患者骨髓间充质干细胞的生物学特征研究目的：通过研究活动期SLE患者与健康对照组的BMSCs在表面抗原标记、细胞增殖能力、分化与迁移能力、细胞周期与凋亡等衰老相关生物学行为方面的差异,探讨SLE患者BMSCs的生物学行为是否存在衰老迹象,从而证实SLE患者的BMSCs是一种衰老的干细胞,进一步揭示SLE潜在发病机制,为同种异体BMSCs移植治疗SLE提供了理论依据。研究方法：1.收集临床资料：收集2015年1～7月期间南方医科大学南方医院皮肤科住院治疗的SLE患者6例,均符合1997年美国风湿病学会(ACR)修订的SLE分类标准,同时参照2012版SLE活动指数评分标准对活动指数进行评估。健康对照组8例,系健康者,均无风湿病史及家族史。SLE组年龄(24±3)岁,其中男性：23-28岁,女性17-26岁；健康对照组年龄(25±5)岁：其中男性：15-28岁,女性23-33岁,两组间年龄差异无统计学意义(t=0.529,P=0.605)。本研究经过南方医院伦理委员会批准,所有患者和健康对照者均签署同意书。2. BMSCs提取及培养：按常规骨穿方法获取骨髓标本。并用Ficoll淋巴细胞分离液按密度梯度离心法及BMSCs贴壁特性分离BMSCs,置于37℃、5%C02培养箱；体外增殖、培养；每3天换液；达80%-90%融合传代。3.选择P4的BMSCs行流式鉴定细胞表面的抗原标记(CD29、CD44、D105、 CD73、CD14、CD34、CD45和HLA-DR)、诱导BMSCs向成骨、成软骨分化；观察BMSCs细胞形态差异；描绘BMSCs生长曲线；BMSCs增殖试验；BMSCs迁移试验；BMSCs细胞周期及凋亡试验。4.统计方法：采用SPSS20.0软件,计量资料用x±S表示；对SLE组和健康对照组进行方差齐性检验,方差齐性则采用两独立样本t检验,方差不齐则采用Mann-Whitney秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1. BMSCs细胞形态：显微镜下观察SLE患者和健康对照者BMSCs (P4)体外生长形态,健康对照组BMSCs呈长梭形,而SLE组BMSCs细胞体积增大、扁平、多角形,呈衰老状态。2. BMSCs成骨、成脂分化能力：SLE患者及健康对照者的BMSCs均能向成骨、成脂分化,SLE患者BMSCs形成钙结节数及脂滴数均少于健康对照者,即SLE患者BMSCs成骨、成脂分化能力均低于健康对照者。3. BMSCs增殖能力：SLE患者与健康对照者的BMSCs生长曲线均呈S形,接种后第2天起细胞进入对数生长期,第8天达到高峰,之后进入平台期。但SLE组BMSCs生长速率较健康对照组慢。4. BMSCs迁移能力：划痕试验24h后,显微镜下观察SLE组和健康对照组细胞24 h迁移距离,评估两组BMSCs的迁移能力,SLE组BMSCs 24 h迁移能力较健康对照组差。5.BMSCs细胞凋亡：SLE组处于早期(Q2)、中晚期(Q4)凋亡的BMSCs细胞比例(17.98%±3.26%,16.80%±9.63%)显著高于健康对照组(8.23%±3.25%,3.33%±2.21%),差异均有统计学意义(tQ2=-3.91, = 0.011; tQ4=-2.99,PQ4=0.048)。6.BMSCs细胞周期：SLE组BMSCs阻滞于G0/G1期的细胞百分比(92.34%±5.80%)显著高于健康对照组(78.65%±3.22%),差异有统计学意义(t=-3.635,P=0.015)；同时其S期所占细胞百分比(0.86%±1.72%)明显低于健康对照组(5.06%±1.874%),差异也有统计学意义(t=3.084,P=0.027)。研究结论：1.活动期SLE患者与健康对照组的BMSCs的表面抗原标记一致无差异；2.SLE患者的BMSCs的增殖能力、分化与迁移能力均明显降低；3.SLE患者的BMSCs细胞周期阻滞于G0/G1期,发生明显早中期凋亡。上述结论提示SLE患者BMSCs的生物学行为符合细胞衰老的特征,即SLE患者的BMSCs是一种衰老的干细胞。第二章：SLE患者BMSCs中P27kip1/PTEN蛋白表达研究研究目的：前述研究已证实SLE患者的BMSCs是一种衰老的干细胞,然而其衰老的机制尚不清楚。细胞周期的失调控被认为在细胞衰老过程中起关键作用,已有研究表明p53/p21CiP1,p16INK4a等细胞衰老相关蛋白调控失常在MSCs衰老调节中扮演着非常重要的角色。P27kip1是一种重要的细胞周期负性调节蛋白,而PTEN是一种抑癌基因,负性调控细胞周期,我们拟通过探讨SLE患者与健康对照组BMSCs内P27kiP1/PTEN蛋白表达水平差异,推测其在SLE患者BMSCs衰老中的作用。研究方法：1.收集临床资料：收集2015年1々7月期间南方医科大学南方医院皮肤科住院治疗的SLE患者6例,均符合1997年美国风湿病学会(ACR)修订的SLE诊断标准,同时参照2012版SLE活动指数评分标准对活动指数进行评估。健康对照组8例,系健康者,均无风湿病史及家族史。SLE组年龄(24±3)岁,其中男性：23-28岁,女性17-26岁；健康对照组年龄(25±5)岁：其中男性：15-28岁,女性23-33岁,两组间年龄差异无统计学意义(t=0.529,P=0.605)。本研究经过南方医院伦理委员会批准,所有患者和健康对照者均签署同意书。2. BMSCs提取及培养：按常规骨穿方法获取骨髓标本。并用Ficoll淋巴细胞分离液按密度梯度离心法及BMSCs贴壁特性分离BMSCs,置于37℃、5%CO2培养箱；体外增殖、培养；每3天换液；达80%-90%融合传代。3.用细胞免疫荧光法检测活动期SLE患者与健康对照组BMSCs (p4)内P27kiP1/PTEN蛋白分布情况；用Image J图像分析软件分析细胞荧光强度并初步定性比较蛋白分布于细胞核、细胞质两者量的差异；4.采用Western-Blot蛋白印迹法及Quantity one图像分析软件,检测并分析活动期SLE患者与健康对照组BMSCs内P27kip1/pTEN蛋白表达水平差异。统计学方法：采用SPSS 20.0软件,计量资料用x±S表示。对SLE组和健康对照组进行方差齐性检验,方差齐性则采用两独立样本t检验,方差不齐则采用Mann-Whitney秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1. P27kiP1/PTEN蛋白分布：SLE组及健康对照组BMSCs内P27kiP1、PTEN蛋白在细胞质及细胞核均有表达,且细胞核内表达量均高于细胞质；2. P27kiP1/PTEN蛋白表达量：SLE患者BMSCs经内参均一化后的P27、PTEN蛋白表达水平(即P27/β-actin,PTEN/β-actin)均高于健康对照者,差异有统计学意义(tP27=-2.784, Pp27= 0.039; tPTEN=-4.812, PPTEN= 0.041)。研究结论：细胞周期蛋白P27kip1/PTEN的表达异常参与SLE患者BMSCs衰老的发生发展。创新之处：(1)本实验追踪细胞衰老这一研究热点,首次从MSCs衰老角度入手,通过分析SLE患者BMSCs的生物学特性异常,明确SLE患者BM-MSCs是一种衰老的干细胞。(2)本研究首次分析p27KiP1/pTEN等衰老调节机制在SLE患者BM-MSCs衰老中的作用,进而探讨衰老调节机制在SLE发生发展中的作用。