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自噬是一种关键性维持细胞稳态的途径,它经历自噬前体-自噬体-自噬溶酶体,以清除功能失调的细胞器和错误折叠的蛋白质等。由于细胞质内部环境复杂、自噬体寿命短,目前开发的观测自噬的荧光探针主要针对最终形成的自噬溶酶体成像,还未实现荧光探针标记最关键的中间环节自噬体,这就迫切要求开发自噬体选择性的定位荧光染料。在文献调研的基础上,本论文合成了一种Mg2+敏感的有机小分子荧光探针,通过蛋白“劫持”的方式与蛋白结合进入自噬体,选择性定位在自噬体中的有机荧光探针对线粒体自噬实时可视化追踪与监测。本文主要研究内容如下:1.设计了一个新颖的多功能性的荧光探针。通过水合肼偶联8-羟基喹啉-5-醛得到探针(HHQ),当HHQ被光激发后,其电子从基态跃迁至激发态,HHQ的羟基上的质子转移到探针分子内部相邻的N杂原子上,实现从烯醇式到酮式的互变异构转变,产生激发态分子内质子转移(ESIPT)过程,阻止HHQ发光。当HHQ与Mg2+配位后,ESIPT被阻断并使HHQ发出强烈的蓝色荧光,且荧光强度与Mg2+显示出很好的线性关系,能够用于细胞内Mg2+的定量化。利用Benesi-Hildebrand plot公式推算出HHQ与Mg2+以1:1的化学计量比配位,并计算出HHQ与Mg2+的结合常数。此外,HHQ还可以在排除其他金属离子尤其是Ca2+的干扰下显示出对Mg2+高度的选择性。2.探针HHQ可能以自由扩散无需能量依赖的方式被细胞摄取,它的分散性能和脂溶性能较好,能够直接穿透细胞膜。HHQ进入细胞后,与细胞中的蛋白质结合,使蛋白质的构象发生变化,诱导细胞发生自噬并“劫持”HHQ进入自噬体。以牛血清白蛋白(BSA)为例,理论计算出了HHQ与BSA的活性位点通过氢键和疏水-疏水作用以2:1的计量比结合,正好进入BSA的疏水空腔中。在第一个结合位点,HHQ与BSA的氨基酸残基相互作用,它与氨基酸残基CYS114(半胱氨酸114位)和LYS116(赖氨酸116位)(α链)形成分子间氢键,与LYS116(β链)等氨基酸残基形成CH…π作用;在第二个活性位点,HHQ与BSA有一个氢键作用,大部分是CH…π作用。此外,Mg2+在细胞线粒体中含量较高,通常以ATP-Mg2+形式存在,因此在自噬过程中,当自噬体和线粒体发生融合时,HHQ可以对Mg2+保持高度的响应。另外,即使在蛋白的存在下,探针HHQ对Mg2+也具有较高响应的能力,HHQ对蛋白质和ATP具有高度抗干扰性。值得注意的是,在酸性条件下HHQ对Mg2+没有响应,表明HHQ只能观测到自噬体,而不能观察到随后形成的酸性自噬溶酶体。3.选择性定位自噬体的探针HHQ可以实时监测线粒体自噬动态过程,当细胞中的线粒体受到外部压力刺激,如营养枯竭、ROS过量和细胞衰老,线粒体被去极化和损伤。正常线粒体形状是丝状,被损害的异常线粒体由点状的自噬体选择特异性的吞噬,发生线粒体自噬,同时释放出大量的Mg2+,Mg2+与定位在自噬体中的探针HHQ配位,形成HHQ-Mg2+复合物,使HHQ荧光“打开”。然后,将线粒体包围的自噬体与溶酶体逐渐融合形成自噬溶酶体。在溶酶体这种酸性环境下会分解复合物HHQ-Mg2+,荧光再次“关闭”。本论文首次报道了有机荧光探针分子可视化监测线粒体自噬过程,对研究细胞中线粒体自噬这一动态过程具有重要的意义。