论文部分内容阅读
目的:利用2型糖尿病患者(type2diabetes mellitus,T2DM)血清干预人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs),观察干预后上清液中丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)、过氧化物歧化酶(superoxideDismutase,SOD)和一氧化氮(nitric oxide,NO)的水平及β淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)40、Aβ42水平的差异,探讨T2DM患者血清对内皮细胞的损伤及其与Aβ40和Aβ42的相关性。方法:1.选取T2DM患者和健康对照者各10例,收集相关资料;培养HUVEC,分别暴露于10%糖尿病患者血清(diadetic serum,DS)、10%健康人血清(healthserum,HS)及10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)中。2.倒置显微镜观察干预30min、3h以及3d时的细胞形态学变化;四甲基偶氮唑蓝法(multiply-table tournament,MTT)观察干预3d时各组血清对细胞生存率的影响3.干预30min、3h、3d后分别取各组细胞上清液,黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力,评定细胞抗氧化能力;硫代巴比妥酸法测定MDA含量,评定脂质过氧化情况;ELISA法测定NO浓度,了解内皮功能;ELISA法检测Aβ40和Aβ42的含量,探讨DS血清对内皮细胞的损伤与Aβ40和Aβ42的相关性。结果:1.细胞形态学变化在30min及3h时各组细胞形态未见明显变化,3d时FBS组和HS组可见细胞结构、形态清楚,大小均匀,呈单层鹅卵石形状紧密排列,DS组可见细胞变圆、皱缩、胞体碎裂,细胞数量减少、排列紊乱。2.各组生存率的变化各组细胞生存率与FBS组比较,均无显著性差异(P>0.05),与HS组(133.33±37.53)比较,DS组(77.46±21.32)细胞生存率显著降低(P=0.000)。3. HUVECs培养上清液中SOD、MDA以及NO的变化3.1DS组HUVECs上清中SOD活力降低在同一时间段,分别在干预30min、3h、3d,FBS组与HS组比较SOD的活力无显著性差异(P>0.05);在干预3h时,DS(25.63±4.50)与FBS(30.67±2.06)和HS(31.08±4.90)比较,能明显增加SOD活力(P值分别为0.006,0.003);在干预3d时,DS(20.67±4.24)与FBS(31.39±1.29)和HS(33.8±5.47)比较,能显著增加SOD活力(P值分别为0.000,0.000)。不同时间段间进行比较,在DS内,30min与3h SOD活力无明显差别(P>0.05),3d(20.67±4.24)时较30min(28.49±3.99)和3h(25.63±4.50)明显降低(P值分别为0.000,0.005);在HS内,各个时间段间均无显著性差异(P>0.05);在FBS内,30min与3h无明显差别(P>0.05),3d(31.39±1.29)较30min(28.86±2.12)和3h(30.67±2.06) SOD的活力明显增加(P=0.005,0.039)。3.2DS组HUVECs上清中MDA水平升高在同一时间段,分别在干预30min、3h、3d时,FBS与HS比较MDA的生成无显著性差异(P>0.05);在干预3h,DS(2.35±0.67)分别与FBS(3.02±0.19)和HS(2.38±0.62)比较, MDA的含量增加(P值分别为0.003,0.001)。在干预3d,DS(5.30±1.00)分别与FBS(3.13±0.39)和HS(3.25±0.80)比较,能显著增加MDA的含量(P值分别为0.000,0.000)。在不同时间段间进行比较,30min与3h比较时各组内MDA含量均无明显差别(P>0.05)。在DS组内,在3d(5.30±1.00)时较30min(3.98±0.81)和3h(2.35±0.67)MDA含量明显增加(P=0.000,0.001);在HS组内,在3d时(3.25±0.80)较30min(2.97±0.66)和3h(2.38±0.62)MDA含量明显增加(P=0.005,0.041);在FBS组内,3d时(3.13±0.39)较30min(2.34±0.58)和3h(3.02±0.19)时MDA的含量明显增加(P=0.001,0.004)。3.3DS组HUVECs上清中NO的产生减少30min和3h时各组差异无统计学意义(P>0.05);3d时,与HS组(430.80±67.93)比较,DS(349.44±63.63)能显著减少NO的含量(P=0.003)。在FBS及HS组内随着时间的延长,NO有逐渐升高的趋势,而DS组内随着时间的延长,NO有逐渐降低的趋势。4. DS对HUVECs培养上清中Aβ40和Aβ42的影响4.1DS组HUVECs上清中Aβ40的浓度增加在同一时间段,分别在干预30min、3h、3d,FBS与HS比较Aβ40的浓度均无显著性差异(P>0.05);在30min、3h及3d时,DS(178.37±58.73,207.12±68.65,286.11±74.83)与HS(161.10±71.83,38.25±56.56,108.25±56.93)比较均能显著升高Aβ40的浓度(P=0.012,0.018,0.001);在3d时DS与FBS(150.27±6.65)比较,能增加Aβ40的浓度(P=0.008)。在DS组内,各个时间段进行比较,3d较30min及3h Aβ40的浓度显著升高(P=0.001,0.015);在HS和FBS组内,各时间段Aβ40的浓度无明显差别(P>0.05)。4.2DS组HUVECs上清中Aβ42的浓度增加30min和3h时各组差异无统计学意义(P>0.05);3d时分别与FBS(33.79±10.69)和HS(48.62±15.62)比较,DS(79.42±43.99)增加Aβ42的浓度(P=0.001,P=0.017)。DS、HS、FBS组内各个时间段间比较无显著性差异(P>0.05)。结论:1.DS以时间依赖的形式损伤HUVECs,表现为细胞生存率的降低、SOD活力的降低、MDA生成的增加以及NO合成减少,且均具有一定的时间依赖性,以3d时的改变最为明显,提示这种损伤是一个慢性的过程,而且内皮细胞损伤机制与氧化应激有关。2.内皮细胞能表达一定量的Aβ40和Aβ42。DS培养的HUVECs上清液中MDA显著升高,而SOD活力显著下降,均具有一定的时间依赖性,并且与Aβ的水平基本平行,提示DS可以通过氧化应激诱导HUVECs损伤的同时伴有Aβ水平的升高,Aβ既可能作为一种损伤因素参与了DS诱导的内皮损伤,也可能是DS中高糖或其他毒性物质通过Aβ导致内皮损伤、Aβ升高只是DS导致内皮损伤的标志物之一。3. DS降低HUVECs生存率的同时明显减少NO的产生,与Aβ升高基本平行,提示内皮源性NO生成减少是Aβ引起内皮功能障碍的标志之一。