第一部分TMT中毒整体动物模型及脑膜片钳技术的建立目的：建立TMT中毒的整体动物体内与脑膜片钳模型,探讨TMT对小鼠的一般毒性作用、神经行为及学习记忆能力的影响。方法：整体动物模型：48只雄性昆明种小鼠随机分为6组,每组8只;分为TMT染毒组：0.25、0.75、1.25 mg/kg和对照组(生理盐水),LBP组(2 g/kg)以及干预组(TMT 1.25 mg/kg+LBP 2g/kg)。对照组及TMT组每日上午8点腹腔注射连续给药5天；LBP及干预组自TMT染毒前3天预先LBP经口灌胃,直至染毒结束。TMT染毒当晚8点进行一般行为学评分与Racine癫痫评分,共5天；末次给药24 h后断头处死动物,分离脑并计算脑脏器系数；每组4只小鼠各保留一半脑,一半用于免疫组化,另一半与其余4只动物的大脑均分离海马,-80℃冻存备用。脑膜片钳模型：设对照组(生理盐水)和TMT组(1.25 mg/kg),每组3只雄性昆明种小鼠。腹腔注射5天,麻醉后游离海马,检测海马CA1区LIP的改变。结果： (1)小鼠体重及脑脏器系数变化：与对照组相比,1.25 mg/kg组TMT染毒第3天开始体重明显下降(P<0.05),与单独TMT组相比,干预组体重明显高于单独TMT组,第8天体重差异有统计学意义(P<0.05)：与对照组相比,TMT高剂量组及干预组脑脏器系数升高(P<0.01)；(2)一般行为变化：TMT可导致小鼠出现神经系统中毒症状,中剂量和高剂量组自TMT给药第3天至染毒结束均表现出一般中毒症状,症状评分分值升高,第4、5天症状评分持续增长,显著高于对照组(P<0.01)；按Racine癫痫评分,TMT可诱发小鼠癫痫,所有剂量组在TMT染毒初期均无明显症状,癫痫分级在0级,TMT染毒完毕后(第5天),对照组及LBP组所有动物仍为0级,0.25 mg/kg组75%的动物在0级,0.75 mg/kg25%动物在1级,25%动物在2级,其余动物在0级,1.25 mg/kg组所有动物在3级以上,其中12.5%在5级,62.5%为4级：与1.25 mg/kg组相比,干预组中毒症状及癫痫评分均有所下降；(3)学习记忆能力改变：应用海马脑片盲法膜片钳技术,发现TMT可引起小鼠海马CA1区LTP降低,明显低于对照组(P<0.01)。结论：本实验室成功建立TMT中毒小鼠整体动物模型,0.75 mg/kg TMT即能引起小鼠中毒一般症状的发生,并可观察到攻击性、易激惹、轻微震颤等症状：1.25 mg/kgTMT可引起持续性震颤、癫痫发作以及体重降低等明显的神经系统中毒表现。TMT给药前3天预先给予LBP,并持续给药至染毒结束,中毒症状有所减轻,LBP对TMT引起的神经毒性有一定的保护作用。1.25 mg/kg TMT可引起昆明种小鼠海马CA1区长时程增强效应降低,从电生理角度,观察到其对学习记忆功能有影响。第二部分TMT对小鼠海马神经元损伤的分子生物学机制研究目的：利用整体动物模型研究TMT对小鼠海马神经元的损伤及其分子生物学机制。方法：尼氏染色及神经元免疫荧光观察神经元损伤；TBA法检测MDA变化；WST-1法检测SOD的改变；免疫组织化学法检测Sonic Hedgehog变化；Western blot检测Sonic Hedgehog、PI3K/Akt信号通路蛋白及凋亡相关蛋白Bcl2/Bax的改变。结果：(1)神经元损伤：尼氏染色结果可见,中、高剂量组海马各区神经元排列紊乱、细胞数量减少、间隙变大、细胞肿胀、尼氏小体减少：免疫荧光结果显示：中剂量组小鼠海马DG区即受损、神经元缺失,高剂量组海马各区神经元均出现缺失；LBP可减轻TMT诱导的海马神经元损伤。(2)TMT对小鼠海马神经元凋亡相关蛋白的影响：与对照组相比,各TMT剂量组海马神经元的Bcl-2表达水平下降,而Bax表达水平升高。与TMT组相比,干预组Bcl-2蛋白表达升高,Bax表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)：(3)MDA及SOD结果显示,随着TMT染毒剂量的升高,海马MDA水平呈上升趋势,与对照组相比,中剂量组和高剂量组及干预组差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比,海马SOD水平随着TMT染毒浓度的升高而降低,高剂量组差异有统计学意义,与1.25 mg/kg TMT组相比,干预组SOD表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)：(4)Sonic Hedgehog蛋白表达变化：中、高剂量组海马CA区Shh蛋白明显减少,表现为棕黄色颗粒物减少；(5)蛋白免疫印迹法检测小鼠海马Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路蛋白表达的变化：与对照组相比,TMT低剂量和中剂量组Shh蛋白表达水平降低,高剂量组上升,总Akt及总GSK-3p水平各组之间无明显差异,p-Akt及P-GSK-3β表达随着染毒剂量的增加而降低：与1.25mg/kgTMT组相比,干预组Shh、p-Akt及p-GSK-3β表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论：TMT在整体动物模型中,可引起神经元尼氏体的丢失,神经元损伤及缺失,利用尼氏染色和免疫荧光方法证实TMT神经损伤的细胞水平物质基础；发现TMT可造成细胞凋亡和氧化应激的异常,其分子生物学机制涉及Sonic Hedgehog信号通路的抑制,表现为关键蛋白Shh及Gli1表达的降低;PI3K/Akt信号通路的抑制,体现为该通路关键蛋白p-Akt的抑制与GSK-3β的活化；脂质过氧化反应的发生等。第三部分Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路在TMT致N2a细胞凋亡模型中的作用目的：建立TMT中毒的体外神经细胞模型,确认Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路是否参与介导TMT引起的N2a细胞凋亡,并探讨LBP对TMT神经毒作用的保护作用。方法：MTT法测定细胞存活率；Hoechst染色观察细胞凋亡；流式细胞术检测细胞凋亡；ELISA法检测caspase-3的变化；DCFH-DA法检测ROS的改变：TBA法检测MDA的变化；WST-1法检测SOD的改变；WB检测Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路及Bcl-2、Bax等蛋白的改变;RT-PCR检测Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路相关mRNA的表达。结果：(1)TMT对N2a细胞存活率的影响：与正常对照组相比,3.75及7.5μmol/LTMT作用24 h,细胞存活率明显下降(P<0.05),并具有剂量反应关系；形态学观察,3.75μmol/L与7.5μmol/L TMT作用24 h后,细胞数目明显减少,突触回缩,细胞贴壁能力减弱,呈球状漂浮： (2)TMT对N2a细胞凋亡的影响：与正常对照组相比,3.75μmol/L与7.5μmol/L TMT作用24 h,细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显增加(P<0.01);Hoechst33258染色可见3.75 μmo1/L与7.5μmol/L TMT作用24 h可使染色体聚集,DNA裂解：Western blot对Bcl-2与Bax蛋白表达进行定量分析,结果显示,随着染毒剂量增加,Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05),而Bax蛋白水平显著增加(P<0.01)： (3)caspase级联反应活化：3.75μmol/L与7.5μmol/L TMT作用24 h可使caspase-9 mRNA表达与caspase-3表达显著升高(P<0.05),LBP可降低caspase的活化(P<0.05)；(4)氧化应激反应的发生：与对照组相比,TMT染毒24h使得ROS与MDA表达水平升高,SOD表达降低。与TMT组相比,LBP可降低ROS与MDA,并使SOD升高(P<0.05)；(5)Sonic Hedgehog及PI3K/Ak信号通路抑制：随着TMT染毒剂量的增加,作用24 h后Shh与Gli1蛋白及Smo mRNA表达降低,Ptch及Sufu的mRNA表达升高(P<0.05)；Akt与GSK-3p磷酸化蛋白及PDK1 mRNA表达显著降低(P<0.05)；而各剂量组TMT对总Akt及GSK-3p蛋白表达变化无明显影响；两条信号通路下游蛋白C-Myc与Cyclin D表达减少(P<0.05)。与3.75μmol/L TMT组相比,LBP对以上指标的改变均有保护作用(P<0.05)。结论：本试验选择N2a细胞为实验模型,TMT染毒剂量为1.875,3.75,7.5μmol/L,LBP给药浓度为300μg/mL,染毒时间为24 h,以细胞凋亡和氧化应激为最终毒性指标,呈现出良好的剂量-毒效应关系。以此为信号通路的研究模型,发现可引起N2a细胞发生凋亡,氧化损伤作用,同时抑制Sonic Hedgehog与PI3K/Ak信号通路,表现为Sonic Hedgehog通路蛋白Shh与Gli1表达的减少及PI3K/Akt通路蛋白Akt及GSK-3β磷酸化程度的降低。LBP对TMT诱导产生的神经元损伤具有保护作用。提示细胞凋亡、氧化损伤、Sonic Hedgehog及PI3K/Akt信号通路的抑制可能参与TMT的神经毒作用机制。第四部分 TMT致N2a细胞损伤模型中Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路的’Crosstalk"目的：以两条信号通路的特异性抑制剂为工具,进一步从蛋白及RNA表达层面研究TMT致N2a细胞凋亡模型中Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路的‘"Cross-talk", GSK-3p在其中扮演的角色及氧化应激与两条信号通路的关系,并观察各抑制剂对TMT致N2a细胞凋亡的影响,以探讨其毒性途径。方法：LY294002预处理N2a细胞1h,GDC-0449预处理细胞2h后,TMT染毒24 h,MTT检测细胞存活率改变：流式细胞术分析各抑制剂对TMT导致的细胞凋亡的影响：RT-PCR检测caspase-9 mRNA改变,ELISA法检测caspase-3的变化；DCFH-DA法检测ROS的改变,TBA法检测MDA的变化；WST-1法检测SOD的改变；RT-PCR检测Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路相关mRNA的表达,Westernblot检测通路相关蛋白表达变化。结果：(1)抑制剂对细胞存活率的影响：与TMT单独染毒组相比,Sonic Hedgehog通路抑制剂GDC-0449与PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理并染毒后细胞存活率降低(P<0.05)；细胞回缩,变圆,细胞数量减少。(2)抑制剂对细胞凋亡的影响：Sonic Hedgehog通路抑制剂GDC-0449与PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理细胞后再进行TMT染毒,细胞总凋亡率显著高于TMT单独染毒组,其中LY294002预处理,晚期凋亡率高于单独TMT染毒组(P<0.01)。抑制剂预处理可使caspase-9 mRNA及caspase-3的表达水平升高(P<0.01)。(3)抑制剂对氧化应激的影响：与单独TMT染毒组相比,10μmol/L PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理或30μmol/L Hedgehog通路特异性抑制剂GDC-0449预处理,均可使细胞ROS荧光强度增加,表达升高(P<0.01)；MDA表达水平上升(P<0.01); SOD表达水平降低(P<0.01).(4) PI3K/Akt信号通路：与TMT单独染毒组相比,10μmol/L PI3K/Akt通路抑制剂LY294002预处理1h,可使磷酸化GSK-3β表达降低(P<0.01)；Ptch、Sufu的mRNA表达升高(P<0.01)；Smo、PDK1的mRNA及Shh、Gli1的蛋白水平降低(P<0.01)(5) Sonic Hedgehog信号通路：与TMT单独染毒组相比,30μmol/L Hedgehog通路抑制剂GDC-0449预处理2h可使磷酸化Akt及磷酸化GSK-3β表达降低(P<0.05)；PDK1的mRNA表达降低(P<0.05),Sufu的mRNA表达升高(P<0.01)。结论：在TMT致细胞凋亡模型中,Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路的抑制可促使细胞凋亡率增加,caspase-9及caspase-3表达升高,具有促进细胞凋亡的作用,并能诱导氧化应激反应的发生。与单一信号通路研究相比,对信号通路之间联系的研究更切合实际。途径研究表明两条信号通路间存在“Cross-talk":Sonic Hedgehog与PI3K/Akt信号通路相互抑制,其中,GSK-3p可能在两条通路之间起到桥梁作用：同时两信号通路与氧化应激之间存在双向调节。两信号通路间与氧化应激的相互调节,最终结局为TMT使caspase家族活化,导致凋亡发生。