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背景:放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury,RILI)是胸部放疗后并发症,临床分为初期放射性肺炎和晚期放射性肺纤维化。近年来关于RILI的研究日益受到学者重视,因其发病机制未完全阐明,目前临床上仍缺乏特别有效的治疗方法。基于碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast growth factor,b FGF)具有血管再生、创伤修复、神经营养和神经再生等的生物学作用,目前重组b FGF已被广泛应用于创伤修复、糖尿病溃疡、脊髓损伤修复、帕金森综合征及阿兹海默病等临床治疗。文献报道b FGF可以促进放射性损伤的修复[1][2],也可能对放射性肺损伤有积极促损伤修复的生物学作用[3]。鉴于此,本课题采用人工修饰方法在b FGF肽链一端添加一个胶原蛋白结合域(collagen binding domain,CBD),构建重组CBD-b FGF,并对小鼠放射性肺损伤的早期进行干预,旨在探讨CBD-b FGF对小鼠放射性肺损伤的生物学作用。第一部分CBD-b FGF在体外的生物学活性及释放目的:比较胶原结合碱性成纤维细胞生长因子(collagen binding domain-basic Fibroblast growth factor,CBD-b FGF)和商品化碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)在生物学活性、胶原结合率及缓释功能的等方面的差异。方法:采用CCK-8方法,检测CBD-b FGF促进人皮肤成纤维细胞(HS-865)的增殖作用,并且和商品化b FGF作对照。将相同浓度的CBD-b FGF溶液和b FGF溶液与大小相近的胶原支架耦合,6小时后将胶原支架从细胞因子溶液中取出,用BCA试剂盒(总蛋白定量测试盒)检测溶液中细胞因子的浓度,计算出CBD-b FGF和b FGF与胶原蛋白的结合效率;在体外不同时间点计算CBD-b FGF和b FGF从胶原里的释放量,绘制释放曲线。结果:在体外,CBD-b FGF促进细胞增殖的生物学活性强于b FGF,与胶原支架的结合率高于b FGF。释放曲线表明,b FGF的释放速度高于CBD-b FGF,CBD-b FGF与胶原结合后具有明显的缓释效果。结论:CBD-b FGF可以高效地结合胶原蛋白,且具有明显的缓释功能,可发挥b FGF的促增殖作用。第二部分CBD-b FGF对小鼠放射性肺损伤早期的干预作用及其机制目的:探索CBD-b FGF对小鼠放射性肺损伤早期的干预作用,并探讨其可能的机制。方法:C57BL/6J雌性小鼠随机分为四组:空白对照组(A组,n=30只),辐射组(B组,n=50只),辐射后第1天给予CBD-b FGF组(C组,n=60只),辐射后第7天给予CBD-b FGF组(D组,n=60只)。(1)小鼠放射性肺损伤模型的构建;A组小鼠作为空白对照,B、C和D三组小鼠全胸接受X线直线加速器辐射,单次,14Gy。(2)CBD-b FGF对放射性肺损伤小鼠的干预:C组小鼠于辐射后第1天、D组小鼠于辐射后第7天,分别气管内滴注CBD-b FGF(2ug/只)。所有小鼠于辐射后1周、2周、4周、8周、12周、16周、20周,观察并检测下列指标:①小鼠体重变化;②小鼠外貌变化;③肺组织切片HE和Masson染色;④免疫组织化学染色法检测小鼠肺组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、I型胶原蛋白(Collagen-I,Col-1)、III型胶原蛋白(Collagen-3,Col-3)、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达。辐射后第20周时,取A、B、C和D四组各2只小鼠进行肺部CT平扫和三维重建。结果:A组小鼠行动自如,呼吸平稳,饮食饮水正常,全身毛发光泽鲜亮。B、C、D三组小鼠辐射后第3天开始出现精神萎靡,反应迟钝,呼吸频率较前升高,进食进水量稍减少,在第2周时辐射野的毛发有少量变白;随着时间延长,小鼠辐射野毛发逐渐变白脱落,但辐射部位皮肤无明显溃烂出血。A组小鼠体重持续增加。B、C、D三组小鼠在辐射后体重均下降,在8周后体重下降速度放缓并出现体重回升,但在16周时体重又开始下降。辐射后第16周、第20周后,C、D组小鼠较B组小鼠体重下降更明显(P<0.05)。肺组织HE、Masson染色显示,与A组比较,B、C、D组小鼠早期有炎症细胞浸润,组织渗出增加,间质炎症改变,间隔增厚;并随着时间的推移,后期肺组织结构破坏,肺间质胶原纤维进展性沉积,肺泡逐渐萎缩甚至消失,肺纤维化形成。C、D两组与B组比较,给予CBD-b FGF后小鼠肺组织HE、Masson染色提示急性放射性肺炎并未减轻,反而在辐射后第16周、20周小鼠肺组织HE、Masson染色提示肺纤维化加重(P<0.05)。小鼠肺组织免疫组化检测显示,B、C、D三组与A组比较,小鼠肺组织中,α-SMA、Col-1、Col-3、TGF-β1表达均显著增多(P<0.001);第20周时,C、D组小鼠肺组织α-SMA、Col-1、Col-3、TGF-β1的表达,较B组小鼠要明显增高(P<0.05);第20周时小鼠肺部CT扫描图像和三维重建图像表明,空白组小鼠肺部C T正常,而辐射组和干预组小鼠肺部表现为两肺弥漫间质性改变。结论:C57BL/6J小鼠胸部接受单次14Gy剂量辐射,能成功构建放射性肺损伤动物模型。放射性肺损伤小鼠早期给予CBD-b FGF干预后,并没有出现加快肺损伤修复效应,反而促进了放射性肺纤维化发生、发展。