【摘 要】
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聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate,PET）具有优异的性能,被广泛应用于食品包装、化工、生活用品和机械电子等众多领域。然而,PET十分稳定而难以被降解的特性也对环境造成了巨大污染,威胁人类的生存。近年来,酶法降解废弃PET这一绿色环保的处理方式引起了越来越多的关注。但目前能用于降解PET的生物酶存在活力低、耐热性差、催化机制未明确等问题,限制了其在工业上的应
【基金项目】
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国家杰出青年科学基金资助项目（31725022）
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聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate,PET）具有优异的性能,被广泛应用于食品包装、化工、生活用品和机械电子等众多领域。然而,PET十分稳定而难以被降解的特性也对环境造成了巨大污染,威胁人类的生存。近年来,酶法降解废弃PET这一绿色环保的处理方式引起了越来越多的关注。但目前能用于降解PET的生物酶存在活力低、耐热性差、催化机制未明确等问题,限制了其在工业上的应用。因此,需要挖掘新型的PET降解酶,研究其结构功能并评估应用潜力,以满足工业应用的需求。本论文以细菌HR29（Bacterium HR29）来源的新型PET水解酶HR-PETase为研究对象,研究了重组蛋白的制备、酶学性质、晶体结构及其对PET的降解效果,为工业应用提供一定指导,同时为深入理解HR-PETase的结构功能关系提供结构基础。具体研究内容以及结果如下:（1）HR-PETase的制备及酶学性质研究通过全基因合成技术获得HR-PETase的基因,构建了p ET-30a-HR-PETase重组表达载体并在E.coli BL21（DE3）中实现异源表达,通过金属螯合层析技术获得了纯度大于90%的HR-PETase,其产量为6.27 mg/L。SDS-PAGE显示蛋白分子量约为29 k Da。酶学性质研究表明,以p NPB为底物,HR-PETase的最适反应温度为75℃,最适p H值为8.5,Tm高达95.6℃,证明HR-PETase是一个极耐高温的碱性酶。此外,HR-PETase对大部分常见的金属离子和有机溶剂有较好的耐受性,表面活性剂能在一定程度上激活HR-PETase,Ca2+等二价金属离子能明显提升HR-PETase的热稳定性。（2）HR-PETase对PET的降解研究采用PET膜和PET粉末对HR-PETase水解PET的效果进行研究,发现HR-PETase水解PET的最适反应温度为70℃,最适反应p H为8.0,在该条件下反应24 h,PET膜的失重率达到78.5%,PET粉末的降解率为91.2%。经过HPLC检测,确定其主要降解产物为对苯二甲酸（terephthalic acid,TPA）和单（2-羟乙基）对苯二甲酸（mono（2-hydroxyethyl）terephthalic acid,MHET）。HR-PETase降解PET粉末的比活力为44.77mg TPAeq.h-1.mgenzyme-1。（3）HR-PETase的晶体结构研究采用凝胶过滤色谱层析获得更高纯度的HR-PETase野生型蛋白,将其浓缩至10mg/m L,分别采用坐滴法和悬滴法对蛋白晶体进行初筛和优化。最终在0.1 M Tris-HCl p H 8.4、19.5%（v/v）乙醇的条件下获得分辨率为1.24?的晶体。通过晶体结构解析,发现HR-PETase是典型的α/β水解酶,由8个α螺旋和9个β折叠通过loop连结而成,具有保守的催化三联体Ser165-Asp210-His242以及一对位于C末端的二硫键:Cys275-Cys293。通过分子对接分析HR-PETase与底物类似物HEMT的相互作用。结果表明,Trp190通过π-π堆积作用稳定底物的芳香环,催化丝氨酸Ser165亲核攻击底物的羰基碳,Tyr95和Met166构成氧负离子洞,与碳基氧形成氢键,稳定反应过程中的四面体结构。HR-PETase的催化核心区域几乎暴露在酶表面,并且位于一条长沟壑中,这一特性使其利于接触并催化固体形态的长链PET分子。
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