柿果实属于跃变型果实,采收后极易软化,给柿果的贮藏运输带来不便。传统的柿果实贮运保鲜不仅费用高且保鲜期有限,不能从根本上解决柿果的采后软化问题。乙烯是一种成熟激素,利用转基因技术抑制或降低跃变型果实乙烯的生物合成,可以降低果实乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果实乙烯生物合成的限速酶,通过转基因的方法抑制这两种酶的表达,可望提高跃变型果实的耐贮性能。本研究以柿果实为材料,克隆分离了富有柿ACC合成酶基因,成功构建了该基因的反义和RNA干扰表达载体,结果如下: 1.利用Rneasy^? Plant Mini Kit试剂盒成功提取了高质量的RNA,RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为2.0979,为mRNA的反转录及3’RACE的扩增奠定了基础。 2.mRNA的反转录采用了QIAGEN公司的反转录试剂盒(Omniscript^TM RT Kit),该试剂盒性能稳定、反转录效率高,分离到的mRNA完整性好,为继后的RT-PCR提供可靠保证。 3.根据已发表的平核无柿ACC合成酶的保守氨基酸序列,设计了多对简并引物,经反复PCR扩增试验,筛选出了具有很好重复性的引物组合,上游引物为:5’-TTYCARGAYTAYCAYGGCYTSCC-3’,下游引物为:5’-AAAKACVCKRAACCARCCCGGYTC-3’。 4.建立了富有柿果ACC合成酶稳定的RT-PCR体系,在50μLPCR体系中:引物（10μM）各2μL,10×PCR Buffer 5μL,dNTP Mixture（2.5mM each dNTP）4μL,cDNA4μL,ddH₂O 32.75μL,Ex Taq DNA Polymerase（5U/μL）0.25μL。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,获得了清晰且重复性好DNA谱带。 5.对DNA谱带回收、测序,得到一个长1178bp的cDNA片段,经序列分析证明该片段具有ACC合成酶的保守区氨基酸序列,与Genbank中平核无柿果的DK-ACS1基因核苷酸序列只有一个核苷酸和一个氨基酸的不同,说明克隆到的片段富有柿果ACC合成酶基因片段。 6.采用3’RACE试剂盒,从富有柿果中克隆出一条长912bp片段,经测序证明是ACC合成酶基因,该片段含有完整的3’RACE引物序列。将扩增到的序列在GenBank中进行BLAST分析,表明其编码区与登录号为AB073005的DK-ACS1序列只有两个核苷酸不同,所编码的氨基酸有一个不同,说明该序列是富有柿果的ACC合成酶的3’末端核苷酸序列。 7.用限制性内切酶Sma Ⅰ和Sac Ⅰ切割克隆到的富有柿果ACC合成酶核苷酸序列和pSMAK311质粒载体,将ACC合成酶的序列反向克隆到了pSMAK311载体35S