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微卫星标记以其数量多、分布广、多态性丰富、检测快速方便、共显性遗传等优点而被广泛应用于个体识别、亲子鉴定、遗传多样性分析、疾病诊断、构建连锁图谱、基因定位等诸多领域,是最具应用价值的标记技术之一。本论文应用微卫星标记对大菱鲆分子辅助育种相关方面进行了探讨,研究结果报道如下:
PCR的优化对微卫星筛选是至关重要的,一般通过改变退火温度,Mg2+浓度等因素来实现,本研究利用本实验室构建的大菱鲆基因组文库设计的引物进行PCR扩增,优化了30对引物的PCR条件。利用大菱鲆51#家系的亲本及100个子代为材料,对30对微卫星标记亲本的分离方式进行了分析。这些分离的标记中,母本标记有25个,父本标记24个和共有标记19个。经卡方检验,其中偏离母本分离比例为16%,偏离父本分离比例为12.5%。
在优化所得的30对大菱鲆微卫星引物中挑选多态性高的10个标记,对大菱鲆15个家系进行了系谱鉴别和遗传多样性研究,评估这10个微卫星标记区分和鉴定大菱鲆家系的能力,进一步探讨家系混养情况下利用微卫星标记辅助构建大菱鲆家系,从而有效促进大菱鲆良种选育进程。10个微卫星位点的平均多态信息含量为0.6746,平均杂合度为0.7142。10个微卫星位点在15个家系分析中,共检测到63个等位基因,每个位点的等位基因数在3-9个之间。根据已知亲本及子代基因型,成功的推断出了15个家系中缺失亲本的基因型。经Cervus3.0软件对10个微卫星基因座排除概率分析表明,在双亲未知的情况下累积排除概率是98.58%,已知单亲时累积排除概率达99.95%。UPGMA聚类分析结果表明,15个家系的297个子代被明显的划分为15个群体,92.6%的个体能够正确的归到家系,分类结果与系谱来源基本一致。结果表明,微卫星标记可以为大菱鲆混养家系进行亲权鉴定和系谱构建提供技术支持。
用10个微卫星标记分析了15个家系亲本间杂合度和距离指数d2对大菱鲆全长、体重的日增量的相关性,结果均表现为负相关,且相关不显著。亲本间杂合度和d2对大菱鲆全长、体重的日增量建立多元回归方程,分别为Y=1.451X1-1.381X2-5.114(杂合度),Y=1.504X1+0.001X2-6.985(d2)。判定系数R2是度量回归方程拟合程度好坏的一个重要指标,而本研究得到回归方程的准确度分别为0.406和0.411,由此可以看出,大菱鲆亲本的杂合度和距离指数对体重的判定系数均较低,还需要进一步研究,为大菱鲆分子选种提供依据。