瓦氏雅罗鱼遗传多样性分析和耐盐碱cDNA消减文库的构建

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瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii(Dybowski))隶属硬骨纲(Osteichthyes)、鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、雅罗鱼属(Leuciscus)。广泛分布于欧洲、黑龙江流域的冷水流域。在我国分布于黑龙江、乌苏里江、嫩江、松花江、牡丹江以及其支流、湖泊、水库,也产于图们江、鸭绿江、辽河等水域。在黄河流域的陕西、甘肃、青海、宁夏等省区也有分布。在内蒙古自治区除额济纳河水系以外,各大水系均有分布。达里湖数量最多,且是该湖的主要经济鱼类。瓦氏雅罗鱼适应能力强,能在pH9.0以上的碱性水域中生活。   本研究以瓦氏雅罗鱼不同群体(达里湖,松花江,乌苏里江,)为研究对象,从生理学、微卫星标记方面着手研究其遗传多样性;利用抑制消减杂交技术构建瓦氏雅罗鱼鳃的cDNA文库,为开展鱼类抗盐碱功能基因的研究打下基础,主要结果如下:   1、本研究以采自达里湖、松花江的瓦氏雅罗鱼F1和绥芬河滩头雅罗鱼Fl为研究对象,比较分析了生活在不同水环境下的雅罗鱼对碳酸盐碱度的适应性。结果表明,达里湖瓦氏雅罗鱼24h LC50极显著高于绥芬河滩头雅罗鱼的24h LC50(P<0.01),显著高于松花江瓦氏雅罗鱼的24h LC50(P<0.05),而在12h、48h、72h、96h的LC50,达里湖瓦氏雅罗鱼均极显著高于松花江瓦氏雅罗鱼、绥芬河滩头雅罗鱼(P<0.01)。在12h、24h、48h、72h、96h的LC50松花江瓦氏雅罗鱼与绥芬河滩头雅罗鱼没有显著性差异(P>0.05)。这说明雅罗鱼对碱度的耐受能力与其生存环境有密切的关系。   2、本实验选用5个瓦氏雅罗鱼微卫星标记和13个草鱼微卫星标记,对分别采自达里湖和乌苏里江的15尾野生瓦氏雅罗鱼个体进行STR-PCR分析。研究结果显示18个微卫星标记共检测到111个等位基因,平均每个基因座扩增得到6.1667个等位基因,观测杂合度(Ho)0.1000~0.9333,平均为0.5315;期望杂合度(He)0.0966~0.9328,平均为0.6298;多态信息含量(PIC)0.0905~0.9113,平均为0.5774;乌苏里江群体的平均等位基因数和平均观测杂合度分别为5.5556和0.5778,达里湖群体的平均等位基因数和平均观测杂合度均低于乌苏里江群体的平均等位基因数和平均观测杂合度,分别为4.3889和0.4852。两个群体间的遗传距离(Dc)为0.2550。个体聚类结果显示达里湖雅罗鱼所有个体聚为一簇,乌苏里江雅罗鱼所有个体聚为一簇。群体间的遗传分化指数(Fst)为0.0855,数值介于0.05~0.15,Nm值为2.6749,表明这两个群体处于中等分化,存在一定程度的基因交流。对两个群体的基因型进行了Hardy-Weinberg平衡的卡方检验,结果表明两群体均在一定程度上偏离了平衡。   3、本实验以盐碱胁迫下瓦氏雅罗鱼鳃组织的cDNA为Tester,淡水生长条件下的鳃组织cDNA为Driver,利用抑制消减杂交技术构建瓦氏雅罗鱼盐碱胁迫下的消减文库。随机从文库中挑选384个克隆进行测序,获得23个有效基因序列,经与公共数据库已知基因比对,有18条是已知基因,5条未知基因,在已知基因中分别与血管生长、氧化还原过程、细胞生长、维持蛋白稳定和维持基本代谢的酶类相关。本实验为抗逆基因的克隆及系统研究盐碱胁迫下瓦氏雅罗鱼相关基因的表达奠定了基础。
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