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背景及目的:鸟分枝杆菌是非结核分枝杆菌中最主要的致病菌,艾滋病晚期患者常常伴发鸟分枝杆菌的感染,近年来随着艾滋病发病率的增长,鸟分枝杆菌感染病例呈现上升趋势。PhoP是PhoP-PhoR双组份系统的效应调节因子,具有一系列的调控功能,对鸟分枝杆菌的毒力起着重要的作用。EsxH为Esat-6家族的蛋白成员,是存在于分枝杆菌早期培养滤液中的一种分泌蛋白,具有较强的免疫活性。研究证实,Esat-6家族蛋白对结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存、繁殖及致病密切相关。为研究PhoP及EsxH在鸟分枝杆菌中的作用,本文通过原核表达系统表达出PhoP、EsxH蛋白,并将其作用于U937细胞,初步探讨了其对巨噬细胞凋亡的作用。本文还构建了PhoP、EsxH基因缺失株,为进一步研究其调控机理奠定了基础及研制抗菌药物提供新靶点。方法:为探讨Pho P、EsxH对细胞凋亡的作用,首先利用PCR扩增出PhoP、EsxH编码序列,与表达载体pGEX-4T-3连接,构建重组载体pGEX-PhoP和pGEX-EsxH,并经测序验证。经序列分析正确后的重组表达载体pGEX-PhoP、pGEX-EsxH用热击法转化入E.coli BL21(DE3),在IPTG作用下诱导表达目的蛋白。用超声破碎仪对菌体进行破碎后,取上清通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱进行纯化GST-PhoP、GST-EsxH融合蛋白。将纯化后的PhoP、EsxH蛋白作用于U937细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。为进一步研究PhoP和EsxH的作用,需要构建其突变体。为此,根据鸟分枝杆菌PhoP基因和EsxH基因序列分别设计两对特异性引物,通过PCR方法扩增出PhoP基因和EsxH基因上、下游片段,将PhoP及EsxH基因上游、下游片段分别进行定向连接后形成PhoP和EsxH基因缺失性同源片段,将片段分别连接到pGMB151自杀质粒构成重组自杀质粒。利用电转化的方法将重组自杀质粒导入到鸟分枝杆菌,由于pGMB151自杀质粒带有sacB特性,在5%蔗糖的压力下诱导质粒丢失并发生同源重组,利用PCR技术进行筛选基因缺失株。结果:PCR扩增PhoP、EsxH基因,产物经琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明PhoP基因片段大小为720 bp,Esx H基因片段大小为294 bp。将PhoP、EsxH克隆入表达载体pGEX-4T-3,在IPTG诱导表达后经10%SDS-Page蛋白电泳显示GST-PhoP融合蛋白分子量大小为52 kDa,GST-EsxH融合蛋白分子量大小为36.5 k Da。将不同浓度的PhoP、EsxH蛋白作用于U937细胞后,经流式细胞术检测细胞凋亡率发现处理组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),处理组细胞凋亡率高于对照组。表明Pho P、EsxH能够促进U937细胞的凋亡,凋亡率随着PhoP、EsxH蛋白浓度的增加而增加。通过PCR扩增出PhoP上游同源片段F1(408 bp)和下游同源片段F2(618 bp),以及EsxH基因上游同源片段F3(501 bp)和下游同源片段F4(516 bp)。在T4 DNA连接酶下F1和F2定向连接成PhoP基因缺失性同源片段F1-F2(1032 bp),F3、F4连接成EsxH基因缺失性同源片段F3-F4(1023bp)。将该片段插入到pGMB151自杀质粒后经PCR和BamH I酶切鉴定显示,含PhoP基因及EsxH基因缺失性同源片段的重组p GMB151自杀质粒构建成功。将该重组质粒分别电转化入鸟分枝杆菌进行同源重组,通过PCR和序列分析证实PhoP基因缺失株PhoP基因缺失了309个碱基;EsxH基因缺失株缺失了294个碱基,缺失部位为EcoR I位点六个碱基GAATTC所取代。结论:表达并纯化了PhoP、EsxH蛋白,PhoP、EsxH蛋白能够促进U937细胞的凋亡。构建了鸟分枝杆菌临床分离株PhoP、EsxH基因缺失突变株,为进一步研究其功能奠定了基础。