肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是最常见的肾脏恶性肿瘤,约占成人恶性肿瘤的3%。当前对于肾癌的治疗仍以手术切除为首选,虽然现代诊断手段使许多病例能早期发现和及时治疗,5年生存率比过去有所提高,但仍有许多患者在确诊时肿瘤已发生转移,丧失了手术的时机,放化疗效果不明显且副作用大。在过去的十多年里,采用干扰素或者白介素-2等进行非特异性免疫治疗被认为是进展期肾癌的治疗标准,但这种治疗方法也仅能在一定程度上延缓病情的进展,随着病情的恶化,大多数患者仍然避免不了死亡,人们期待有一种新的治疗方法可以解决这一难题。20世纪70年代杂交瘤技术的问世,用单克隆抗体作为药物和以抗体为载体耦联放射性同位素、毒素或药物的“生物导弹”风靡全球,这种“靶向治疗”的最大好处就在于单克隆抗体针对肿瘤的特异性靶点起作用,在杀伤肿瘤细胞的同时基本不损伤正常组织。但这些抗体在实际应用于人类疾病的治疗时,由于抗体的异源性,会产生人抗鼠抗体(HAMA反应),同时由于抗体本身的效应功能有限,往往达不到预期杀伤肿瘤细胞的作用。在过去的20多年里,分子生物学的发展大大推动了重组抗体技术的前进,其中噬菌体展示技术最具代表性,但采用该方法所筛选到的抗体为单链抗体scFv或Fab,且亲和力往往较低,表达及纯化难度大,通常需转成全长抗体以高效表达和进一步的亲和优化。为了解决这一系列的难题,科研工作者进行了长期的努力,将跨膜序列融合在抗体重链恒定区的3’端,这样带有跨膜序列的抗体重链与相应的轻链在细胞内共同表达以后,能够将抗体展示在哺乳动物细胞表面,结合流式细胞仪的分选功能,可以高效筛选全长人源抗体。从抗体库中分离特异性抗体所能获得抗体的亲和力与抗体库库容量成正比,迄今为止,能在哺乳动物细胞表面展示的抗体库库容量太小,最高仅为106,难以达到筛选高质量抗体的要求。如何构建大容量的能够在哺乳动物细胞表面展示的抗体基因库,是一个需要解决的重要课题。本实验设计并合成了一个通用的全长人源抗体真核表达载体pDGB-HC-TM,适用于快速构建大容量基因库,并可在哺乳动物细胞表面表达全长人源抗体。该载体携带有重链恒定区和跨膜序列,采用SfiⅠ酶切后可插入轻链的全长基因,BsmBI酶切后可插入重链的可变区基因。我们从肾癌患者外周血B淋巴细胞中克隆了抗体全长Kappa型轻链(LCκ)和重链可变区(VH)的全套基因,分别插入载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO10,构建轻、重链抗体基因库,然后将轻、重链抗体基因库联合转染293T细胞,流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达,结果表明我们成功构建了一个大容量且能在哺乳动物细胞表面表达的的全长人源抗肾癌抗体基因库,为后期筛选治疗性抗体应用于肾癌的靶向治疗打下了良好的基础。一、用于快速构建大容量基因库和展示全长人源抗体的真核表达载体的设计与鉴定目的：获得一种通用的真核表达载体,用于快速构建大容量基因库且能够在哺乳动物细胞表面展示全长人源抗体。方法：提取人外周血淋巴细胞总RNA作为模板,采用RT-PCR的方法克隆重链的可变区,通过第2次PCR,在可变区的5’端起始密码子前引入-NheⅠ-BstⅪ-SfiⅠ-BsmBⅠ-酶切位点,在可变区的3’端引入第2个-BsmBⅠ-酶切位点,同时扩增人抗体IgG1的恒定区,在恒定区的5’端引入与第2个-BsmBⅠ-酶切位点相配的BsmBⅠ识别(切割)序列,在恒定区的3’端引入-BamHⅠ-酶切位点。接着扩增血小板衍生的生长因子受体的跨膜序列,在跨膜序列的5’端引入BamHⅠ-酶切位点。最后以上述PCR产物为模板,采用引物进行连接和扩增,获得含有人抗体重链全长基因和跨膜序列的PCR产物。经NheⅠ和XhoⅠ酶切后,插入到pcDNA5／FRT载体的多克隆位点中相应酶切位点之间。设计引物5’-CTAACTGACACACATTCCACAGAAGCTTCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGG-3’与5’TGTATCTTATCATGTCTGTATACCGAAGCTTCCTCTAGCTAGAGCTTGGCG-3’,分别含有HindⅢ-酶切位点,以上述中间载体为模板进行PCR, PCR产物经HindⅢ酶切后进行自我连接环化,从而切除中间载体的潮霉素表达框架。对所获得的表达载体质粒DNA与扩增到的抗体基因用“NheⅠ和XheⅠ"、SfiⅠ、BsmBⅠ和BstⅪ等4组不同的限制性内切酶进行酶切,纯化酶切后的DNA片段,然后再将各组片段按一定比例混合,采用T4DNA连接酶连接过夜,电击转化感受态大肠杆菌TOP010,比较4组之间无效克隆背景率和连接转化效率的差异。无效克隆背景率的比较采用χ2检验,以P<0.05为有显著性差异。293T细胞的转染在12孔细胞培养板中进行,48～60 h后将细胞消化,采用流式细胞仪进行检测,由FCSExpress V3软件对流式细胞仪产生的数据进行分析。结果与讨论：获得一个长度为5.2 kb的载体pDGB-HC-TM,通过必要的酶切鉴定均可得到与理论上大小一致的片段,插入的HC-TM片段经序列测定和软件分析结果表明其拥有正确的融合蛋白编码序列。酶切分析结果表明,“NheⅠ和XheⅠ”酶切组的无效克隆背景率为8.6%,SfiⅠ、BsmBⅠ和BstⅪ酶切组无效克隆背景率分别为4.3%、2.9%和1.2%,采用SPSS13.0对无效克隆背景率进行χ2检验,结果显示χ2=370.551,P<0.001,4组之间的无效克隆背景率存在统计学差异,“NheⅠ和XheⅠ”酶切组的无效克隆背景率(8.6%)高于其他3组。用转化效率为3×107的感受态细菌进行转化,4组连接转化效率依次为0.94×106(克隆数／μg DNA,以下同),1.6×106、3.2×106和1.6×106,可见“NheⅠ和XheⅠ”酶切组的连接转化效率低于其他3组。流式细胞仪检测到轻、重链均可在293T细胞表面有效表达,单克隆质粒DNA配对后转染293T细胞阳性率达到50～60%,轻重链抗体基因库联合转染的阳性率亦可达到40%左右。结论：通过载体的优化和改造,获得了能用于快速构建大容量基因库和展示全长人源抗体的真核表达载体pDGB-HC-TM。二、采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库目的：采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源抗肾癌抗体基因库,为下一步筛选天然抗体药物奠定基础。方法：首先分离肾癌患者外周血淋巴细胞,提取总RNA,设计并合成引物,用RT试剂盒逆转录合成第1链cDNA,再通过PCR扩增抗体全长Kappa型轻链(LC K)和重链可变区(VH)。用SfiⅠ酶切本室构建好的真核表达载体pDGB-HC-TM和扩增到的LC K,T4DNA连接酶连接过夜,电击转化感受态大肠杆菌TOP010,得到的菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素的平皿。根据长出的克隆数计算轻链抗体基因库库容量。再向平皿中加入LB培养基,刮下所有的菌落,离心后弃上清,沉淀即为轻链抗体基因库。在收集菌落前,随机挑选10个克隆接种过夜,取少量菌液送Invitrogen公司测序。用BsmBⅠ酶切载体pDGB-HC-TM(pDGB-HC-TM经BsmBⅠ酶切后仍携带有重链恒定区)与扩增到的VH,按上述制备轻链基因库的方法制备重链抗体基因库。从轻、重链抗体基因库中各随机挑选的10个克隆接种过夜后菌液采用试剂盒行质粒小提,共得20份质粒DNA,轻链质粒DNA配对pDGB-HC-TM (pDGB-HC-TM经鉴定过可以表达全长的重链),重链质粒DNA配对pDGBCZR1 (pDGBCZR1经鉴定过可以表达全长的轻链),每份配对后的质粒DNA转染293T细胞。用流式细胞仪分析抗体在293T细胞表面的表达,由FCS ExpressV3软件对流式细胞仪产生的数据进行分析。结果与讨论：电泳图上可见到明显的28 S与18 S条带,且28 S的亮度为18 S的两倍,计算A260／A280比值为1.9,说明mRNA的完整性好。RT-PCR扩增到LCκ,其分子量大小为750 bp左右,扩增到VH,其分子量大小为450 bp左右。SfiⅠ酶切轻链PCR产物后插入载体并导入感受态细菌TOP010,根据在带有氨苄青霉素抗性LB平皿上长出的克隆数,计算所构建的轻链抗体基因文库容量为1.36×105,其中有9个经序列测定和软件分析鉴定含有正确的LC K编码序列,而且这些编码序列没有重复。BsmBⅠ酶切的重链PCR产物插入载体后,通过相同方法构建的重链抗体基因文库容量为1.13×106,其中有8个经序列测定和软件分析鉴定含有正确的VH编码序列,而且这些编码序列没有重复。该抗体库容量理论上可达到1.1×1011[(1.36×105×90%)×(1.13×106×80%)]。采用流式细胞仪及FCSExpress V3软件分析,轻重链能够在细胞内自由配对并在细胞表面表达抗体,从轻、重链抗体库中随机挑选的克隆各有7个检测到全长人源抗体的表达,计算得出该抗体库的可表达库容量为7.5×1010[(1.36×105×70%)×(1.13×106×70%)]。结论：采用哺乳动物细胞表面展示技术成功构建了一个全长人源抗肾癌抗体基因库,其可表达库容量高达7.5×1010,抗体的多样性可以满足下一步筛选天然抗体药物的要求。